刁小偉，李園，皮玉瑞，李同輝，劉平，盧山

細(xì)胞與分子生物學(xué)

雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞中雄激素受體上調(diào)EphA3表達(dá)

刁小偉，李園，皮玉瑞，李同輝，劉平，盧山△

目的探討雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞中促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞A型受體（EphA）3表達(dá)和雄激素受體（AR）信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)。方法首先通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）分別檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和22Rv1中EphA3和AR的mRNA及蛋白水平，然后用雙氫睪酮（DHT）刺激48 h，測(cè)定細(xì)胞EphA3、AR和前列腺特異抗原（PSA）表達(dá)水平的變化。同時(shí)，將成功構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒EphA3-Luc（-789～+146）與AR表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-AR或AR特異性小分子干擾RNA（siAR）共轉(zhuǎn)染22Rv1細(xì)胞，分析AR對(duì)EphA3轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的影響。結(jié)果EphA3在前列腺基質(zhì)細(xì)胞WPMY-1中表達(dá)水平極低，但在前列腺癌細(xì)胞LNCaP和22Rv1中則明顯升高，與AR表達(dá)模式相似。10 nmol/L DHT不僅明顯上調(diào)22Rv1細(xì)胞中AR、PSA和EphA3表達(dá)水平，也顯著升高LNCaP細(xì)胞中相關(guān)基因和蛋白水平。而且細(xì)胞內(nèi)不同AR表達(dá)水平會(huì)顯著影響EphA3啟動(dòng)子活性。結(jié)論AR通過提高EphA3啟動(dòng)子活性上調(diào)EphA3表達(dá)水平。

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的肝細(xì)胞A型受體3；雙氫睪酮；受體，雄激素；前列腺腫瘤；調(diào)節(jié)

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞（Erythropoietinproducing hepatocellular，Eph）A型受體（Type A recep?tor，A）3是重要受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine ki?nases，RTK）家族中第一個(gè)被克隆出來的Eph受體亞族成員［1］，不僅參與調(diào)控正常細(xì)胞的生理活動(dòng)［2］，還高表達(dá)于多種腫瘤，如胃癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤和肉瘤等［3-5］，在與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)的血管生成、干細(xì)胞維持和細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用［2，6］。因此，

近年來被認(rèn)為是抑制腫瘤細(xì)胞生長、治療癌癥的重要靶點(diǎn)［6-7］。然而，在肺癌中卻觀察到EphA3能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長［8］；在出現(xiàn)衰老特征的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中EphA3被認(rèn)為是抑癌候選基因［9］。上述研究結(jié)論的矛盾性說明EphA3可能針對(duì)不同腫瘤在表達(dá)及功能上有其特異性，但迄今為止，前列腺癌中有關(guān)EphA3的表達(dá)與調(diào)控，EphA3與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的雄激素受體（Androgen receptor，AR）信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)及調(diào)控機(jī)制鮮見報(bào)道。因此，本研究借助分子生物學(xué)方法檢測(cè)了雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞中EphA3表達(dá)水平以及雙氫睪酮（Dihydrotestosterone，DHT）刺激條件下相關(guān)基因水平的變化，并構(gòu)建EphA3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組載體與AR表達(dá)質(zhì)?；駻R特異性siRNA（AR siRNA，siAR）共轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，探討AR對(duì)EphA3表達(dá)的影響，為前列腺癌的診治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)將WPMY-1細(xì)胞（上海復(fù)祥生物科技）、LN?CaP細(xì)胞和22Rv1細(xì)胞（南京軍區(qū)總院王建東博士饋贈(zèng)）接種于含有100 U/mL青霉素（Hyclone）、100 g/mL鏈霉素（Hy?clone）和10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Wisent）中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。

1.2 DHT刺激待細(xì)胞覆蓋率達(dá)60%時(shí)，換入含有10% Charcoal-stripped FBS（SFBS，HyClone）的phenol-free RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）。饑餓3 d后，加入不同濃度DHT（北京百靈威科技）刺激48 h。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）RT（HiScript Q RT Su?per Mix for qPCR）和PCR（2×Taq Master Mix）試劑均來自南京諾唯贊生物科技公司。利用Trizol（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AR［10］、PSA［11］、EphA3［3］和β-actin特異性引物（FW：5′-GAGCTACGAGCT?GCCTGACG-3′；RV：5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′）均由上海捷瑞生物工程公司合成。反應(yīng)條件為94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.4 Western blot采用RIPA裂解液（江蘇碧云天）收集細(xì)胞總蛋白，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室方法［12］測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。然后，分別孵育一抗和二抗，再加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑（上海天能科技），使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技）檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平。β-actin、AR、EphA3、Sp1和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購自Santa Cruz公司，PSA抗體則來源于Dako公司。

1.522 Rv1細(xì)胞基因組DNA的分離將胰酶消化的細(xì)胞收集于40 mL蔗糖裂解液［0.32 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、5 mmol/L MgCl2和1%Triton X-100］中，離心移去部分上清，與重懸緩沖液［0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）和1.5 mmol/L MgCl2］混勻。二次離心后，加入0.5 mL 10×TEN溶液［0.21 mol/L Tris-HCl（pH7.5）、0.29 mol/L EDTA和1 mol/L NaCl］，0.25 mL蛋白酶K（2 g/L）和0.5 mL 10%SDS，37℃放置過夜。再用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶異戊醇（24∶1）、0.4 mol/L NaCl和2倍體積的100%乙醇依次純化基因組DNA，并溶解于雙蒸水中。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因重組載體的構(gòu)建利用JASPAR數(shù)據(jù)庫（Copenhagen，Denmark）分析EphA3啟動(dòng)子區(qū)域［1］，在-615～-601區(qū)域發(fā)現(xiàn)潛在AR結(jié)合位點(diǎn)，即雄激素應(yīng)答元件（Androgen response element，ARE）。因此，在EphA3啟動(dòng)子序列的-789～+146區(qū)域設(shè)計(jì)上、下游引物，并添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，即分別為F-CCGCTCGAGCTCCCTTCCGTAA?GATGA和R-CCCAAGCTTCTTTGAAGAGCGTGAGCC（下劃線為限制性酶切位點(diǎn)）。以22Rv1細(xì)胞的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用XhoⅠ和HindⅢ酶切PCR產(chǎn)物、割膠純化，與pGL3-Basic線性空載體按比例混合，加入T4 DNA連接酶，過夜后轉(zhuǎn)化入DH5α，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，利用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。所有重組子均經(jīng)過酶切及測(cè)序分析（生工生物工程公司）。

1.7 瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶活性測(cè)定AR表達(dá)質(zhì)粒，pcDNA3.1（+）-AR為Dr.Huang Haojie（Mayo clinic）饋贈(zèng)，siAR［13］由上海英駿生物技術(shù)公司合成。選用Lipofectamine 2000（Invitrogen）對(duì)種植于24孔板中、覆蓋率達(dá)50%左右的22Rv1細(xì)胞分為4組進(jìn)行轉(zhuǎn)染（n=3）。每孔均加入400 ng熒光素酶重組子和10 ng pRL-TK內(nèi)參。AR過表達(dá)組再加入400 ng AR質(zhì)粒，對(duì)照組為pcDNA3.1（+）空載質(zhì)粒；AR敲除組則加入20 pmol siAR，對(duì)照組為熒光標(biāo)記的siRNA陰性對(duì)照（FAM-siRNA NC）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。48 h后，嚴(yán)格遵守Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）操作，用Thermo Scientific Luminoskan Ascent分析儀測(cè)定細(xì)胞裂解液的螢火蟲（firefly）和海腎（Renilla）熒光素酶活性，啟動(dòng)子的相對(duì)活性用兩者比值表示，并經(jīng)相應(yīng)對(duì)照組結(jié)果校正。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次以上，選取有代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel和GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間的均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本資料t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌細(xì)胞中EphA3表達(dá)水平與前列腺正?；|(zhì)細(xì)胞WPMY-1相比，EphA3在高表達(dá)AR的雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP和22Rv1中的mRNA和蛋白水平均顯著升高；且EphA3在兩種細(xì)胞中的表達(dá)模式與AR幾乎一致，見圖1（22Rv1細(xì)胞中還存在AR剪切變異體表達(dá)的突變蛋白，如圖中箭頭所示）。因此，推測(cè)EphA3表達(dá)水平可能與AR調(diào)節(jié)有關(guān)。

2.2 DHT刺激上調(diào)EphA3表達(dá)當(dāng)加入一定濃度

DHT后，22Rv1細(xì)胞中AR、PSA和EphA3的mRNA水平均明顯升高，見圖2A；AR、PSA和EphA3在蛋白水平上也出現(xiàn)顯著增加，見圖2B。同時(shí)，LNCaP細(xì)胞的AR和PSA蛋白水平也隨著DHT濃度上升而增加，當(dāng)DHT為10 nmol/L時(shí)，EphA3蛋白水平升高2倍左右；此外，以在正常培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞作為陽性對(duì)照，其AR、PSA和EphA3蛋白水平也有一定程度增加，見圖2C。提示雄激素信號(hào)通路的激活能夠增加AR表達(dá)，提高AR轉(zhuǎn)錄活性，還誘導(dǎo)了EphA3表達(dá)。

Fig.1The expression levels of EphA3 and AR in androgen-dependent prostate cancer cells圖1 前列腺癌細(xì)胞中EphA3和AR的表達(dá)水平

Fig.2The effects of DHT on AR，PSA and EphA3 expressions inhuman androgen-dependent prostate cancer 22Rv1 and LNCaP cells圖2 DHT對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP和22Rv1中AR、PSA和EphA3表達(dá)的影響

2.3 EphA3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果熒光素酶的報(bào)告基因質(zhì)粒EphA3-Luc（-789～+146）是在pGL3-Basic載體上插入EphA3啟動(dòng)子片段，見圖3A。重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果顯示，泳道1是限制性內(nèi)切酶XhoⅠ切割pGL3-Basic載體后獲得的線性質(zhì)粒DNA全長片段，約5 000 bp，與理論值4 818 bp基本吻合；泳道2是PstⅠ（位于EphA3啟動(dòng)子-246～-243區(qū)域里）單酶切重組質(zhì)粒獲得的片段，推測(cè)長度應(yīng)為5 753 bp，與圖中6 000 bp位置基本一致；泳道3則是利用PstⅠ和BamHⅠ（位于pGL3-Basic上）共同作用的產(chǎn)物，基本符合3 394 bp和2 359 bp的預(yù)期位置，見圖3B。由此，能夠初步確認(rèn)已完成EphA3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行正反向測(cè)序及DNAMAN軟件比對(duì)，發(fā)現(xiàn)插入片段和EphA3啟動(dòng)子序列完全一致，證實(shí)已成功構(gòu)建EphA3啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，見圖4。

Fig.3Construction of luciferase reporter plasmid EphA3 gene promoter圖3 EphA3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

2.4 AR的表達(dá)水平對(duì)EphA3啟動(dòng)子活性的影響EphA3-Luc（-789～+146）與AR表達(dá)質(zhì)?；騭iAR共轉(zhuǎn)染22Rv1細(xì)胞的雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，AR過表達(dá)能顯著提高啟動(dòng)子活性；反之，AR表達(dá)受抑制，啟動(dòng)子活性則顯著下降，見圖5。說明AR能夠影響EphA3啟動(dòng)子活性，即AR能夠通過影響EphA3轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)EphA3表達(dá)水平。

3 討論

3.1 AR對(duì)EphA3表達(dá)水平的影響有文獻(xiàn)報(bào)道前列腺癌細(xì)胞LNCaP中EphA3的mRNA高水平表達(dá)［14］，本研究不僅證實(shí)LNCaP細(xì)胞中EphA3的mRNA水平上升，也發(fā)現(xiàn)其蛋白水平異常，還在22Rv1細(xì)胞中觀察到同樣現(xiàn)象，EphA3表達(dá)水平與細(xì)胞中AR表達(dá)模式相似。同時(shí)，EphA3在前列腺癌22Rv1細(xì)胞中無論mRNA還是蛋白水平上均能受到DHT誘導(dǎo)表達(dá)；而且，EphA3受DHT誘導(dǎo)的變化趨勢(shì)與AR作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的PSA水平變化相

一致。此外，DHT刺激LNCaP細(xì)胞EphA3后蛋白水平也顯著上升。因此，AR能夠上調(diào)EphA3表達(dá)。最近有文獻(xiàn)報(bào)道雄激素誘導(dǎo)的前列腺亮氨酸拉鏈基因（Prostate Leucine zipper gene，PrLZ/PC-1）能夠促進(jìn)EphA3表達(dá)［15］，這也說明AR可能會(huì)上調(diào)EphA3。但值得注意的是，曾有文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)來源于LNCaP細(xì)胞的雄激素依賴性細(xì)胞LNCaP-C33和雄激素非依賴性細(xì)胞LNCaP-C81進(jìn)行的基因芯片分析顯示，EphA3表達(dá)水平在后者中顯著升高［16］。盡管LNCaP細(xì)胞向雄激素非依賴性轉(zhuǎn)變的過程中，AR作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控PSA的作用會(huì)受到抑制，但還會(huì)涉及到很多其他基因以及信號(hào)通路的變化；并且雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞中AR表達(dá)水平不一定減少；也不能進(jìn)一步推斷雄激素依賴性細(xì)胞LNCaP-C33中敲除AR后EphA3表達(dá)就會(huì)出現(xiàn)上升。所以，雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞中出現(xiàn)這樣的結(jié)果很可能歸因于針對(duì)不同前列腺癌進(jìn)展階段EphA3的表達(dá)和調(diào)控都有其特異性，也可能還存在其他EphA3調(diào)節(jié)通路等，需要進(jìn)一步研究。

Fig.4Sequencing analysis of EphA3 promoter luciferase reporter plasmid圖4 重組EphA3啟動(dòng)子質(zhì)粒的測(cè)序分析

Fig.5The effects of increasing or reducing AR expressions on EphA3 promoter luciferase activity in 22Rv1 cells圖5 22Rv1細(xì)胞中增加或抑制AR表達(dá)水平對(duì)EphA3啟動(dòng)子熒光素酶活性的影響

3.2 AR調(diào)節(jié)EphA3表達(dá)的機(jī)制AR屬于核受體超家族中的類固醇受體，在前列腺癌中高表達(dá)。許多研究已證實(shí)AR與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及其信號(hào)通路密切關(guān)聯(lián)，且阻斷AR的下游信號(hào)已成為前列腺癌治療的新策略［17］。AR通常由4個(gè)結(jié)構(gòu)域——N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（NTD）、DNA結(jié)合區(qū)（DBD）、鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合區(qū)（LBD）組成。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于失活狀態(tài)的AR能夠依賴雄激素等配體的結(jié)合而被激活進(jìn)入核內(nèi)，再與靶基因啟動(dòng)子上特異性DNA序列ARE位點(diǎn)相結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)［18］。對(duì)EphA3啟動(dòng)子區(qū)域的分析發(fā)現(xiàn)在-615～-601處有潛在的ARE結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)AR表達(dá)水平的變化顯著影響EphA3啟動(dòng)子活性。因此，推測(cè)AR很可能通過與ARE位點(diǎn)結(jié)合來直接調(diào)節(jié)EphA3的表達(dá)。但AR對(duì)下游基因的調(diào)控，除了作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合ARE發(fā)揮作用外，也可以作為轉(zhuǎn)錄輔助因子與其他蛋白結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。如AR能與轉(zhuǎn)錄因子Sp1蛋白形成復(fù)合物依賴Sp1結(jié)合位點(diǎn)，共同調(diào)節(jié)下游基因如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因p21和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）［19-20］。因此，EphA3啟動(dòng)子區(qū)域ARE位點(diǎn)是否就是AR作為轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合區(qū)域，還是與其他蛋白共同作用來調(diào)節(jié)EphA3轉(zhuǎn)錄水平以及在此調(diào)節(jié)過程中EphA3核心啟動(dòng)子區(qū)域是否還有其他起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等，都還有待于深入探討。

AR及其信號(hào)通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)

揮重要的作用，本研究發(fā)現(xiàn)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞高表達(dá)EphA3；同時(shí)，EphA3的表達(dá)水平也能夠隨AR信號(hào)通路的激活而增加；而且EphA3啟動(dòng)子活性能夠應(yīng)答AR表達(dá)水平的變化。這些結(jié)果說明了EphA3與前列腺腫瘤重要影響因子AR的關(guān)聯(lián)。因此，對(duì)EphA3在前列腺癌中的作用進(jìn)行深入研究，能夠?yàn)榍傲邢侔┑脑\治提供新的理論依據(jù)。

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（2015-04-14收稿 2015-06-11修回）

（本文編輯 李鵬）

Androgen receptor up-regulates EphA3 expression in androgen-dependent prostate cancer cell lines

DIAO Xiaowei，LI Yuan，PI Yurui，LI Tonghui，LIU Ping，LU Shan△
1 College of Life Science，Nanjing Normal University，Nanjing 210023，China；2 Jiangsu Provincial Key Laboratory of Molecular Medicine，Nanjing Normal University△

ObjectiveTo evaluate the relationship between liver cell type A receptor（EphA）expression and androgen receptor（AR）signaling in androgen-dependent prostate cancer cells.MethodsRT-PCR and Western blot assay were used to determine mRNA and protein levels of EphA3 and AR in prostate cancer LNCaP and 22Rv1 cells，respectively.The variations of EphA3，AR and prostate specific antigen（PSA）expressions were also measured in these cells after dihydrotes?tosterone（DHT）treatment for 48 h.The constructed EphA3-Luc（-789-+146）luciferase reporter plasmid was co-transfect?ed with pcDNA3.1（+）-AR or siAR in 22Rv1 cells to analyze the effects of different AR expression levels on EphA3 tran?scription activity.ResultsThe expression pattern of EphA3 was similar to AR，showing a lower level in prostate stromal cell line WPMY-1 and a higher level in prostate cancer cell lines LNCaP and 22Rv1.When stimulated with 10 nmol/L DHT，the expression levels of AR，PSA and EphA3 were significantly increased in 22Rv1 cells，and the protein levels of these genes were also increased in LNCaP cells.Moreover，AR expression levels markedly influenced the activity of EphA3 pro?moter.ConclusionAR up-regulates EphA3 expression by increasing the activity of EphA3 promoter.

EphA3；dihydrotestosterone；receptors，androgen；prostatic neoplasms；regulation

R737.1，R73-37

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.009

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172007、81272850）

1南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（郵編210023）；2南京師范大學(xué)江蘇省分子醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

刁小偉（1988），男，碩士在讀，主要從事前列腺癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究

△通訊作者E-mail:lu_shan@hotmail.com