陳霞，趙宏賢，王巧稚，李昌平

大黃素對(duì)重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障的保護(hù)作用及機(jī)制

陳霞1，趙宏賢2，王巧稚2，李昌平1

目的從細(xì)胞凋亡方面，探討大黃素對(duì)重癥急性胰腺炎（SAP）腸黏膜功能障礙的保護(hù)作用及相關(guān)作用機(jī)制。方法SD大鼠30只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、SAP組和大黃素組。采用胰管逆行注射3%?；悄懰徕c溶液制作SAP模型，大黃素組制作SAP模型1 h后給予大黃素25 mg/kg腹腔注射，2 h后重復(fù)1次。TUNEL法檢測(cè)回腸黏膜細(xì)胞凋亡；免疫組化法檢測(cè)回腸黏膜細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組相比，SAP組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡及GRP78蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與SAP組相比較，大黃素組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡減少（P＜0.05），GRP78蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論大黃素可減少SAP時(shí)的腸黏膜細(xì)胞凋亡，保護(hù)腸黏膜屏障，但這種保護(hù)作用似乎并未涉及到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。

胰腺炎，急性壞死性；急性??；腸黏膜；大黃素；細(xì)胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley；重癥急性胰腺炎；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

腸黏膜屏障在維護(hù)腸功能中起著重要作用。腸黏膜屏障功能障礙（IBFD）是嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)表現(xiàn)之一，與重癥急性胰腺炎（SAP）病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)［1-2］。SAP時(shí)IBFD是多因素共同作用下的病理生理過(guò)程。近期研究發(fā)現(xiàn)，SAP時(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡增加，而腸黏膜細(xì)胞凋亡的抑制可改善腸黏膜屏障損傷，并減輕SAP時(shí)的內(nèi)毒素血癥［3-4］。大黃在臨床中常單獨(dú)或聯(lián)合用于SAP腸功能障礙的治療，然而大黃對(duì)SAP腸功能障礙防治作用的相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚。大黃素是大黃的主要有效成分之一。本課題擬建立SAP大鼠模型，從細(xì)胞凋亡著手，探討大黃素對(duì)SAP時(shí)腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料健康純系清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供；?；悄懰徕c購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；TUNEL試劑盒（瑞典Roche Diagnostics公司）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）抗體購(gòu)于美國(guó)Bioword公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及SAP造模SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。（1）假手術(shù)組：麻醉后開(kāi)腹，胰管逆行注射生理鹽水1 mL/kg，縫合腹腔。（2）SAP組：胰管逆行注射3%?；悄懰徕c溶液1 mL/kg。（3）大黃素組：胰管逆行注射3%牛磺膽酸鈉溶液1 mL/kg，1 h后腹腔內(nèi)注射大黃素25 mg/kg，2 h后重復(fù)注射1次。所有動(dòng)物術(shù)后均給予皮下注射生理鹽水5 mL以補(bǔ)充血容量。自由飲水、進(jìn)食。

1.2.2 病理學(xué)觀(guān)察造模24 h后取胰腺組織，將胰腺置于10%中性甲醛中固定，行常規(guī)病理HE染色檢查。光鏡下觀(guān)察胰腺病理改變。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取回腸組織，常規(guī)石蠟切片制作，TUNEL法檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞凋亡。操作步驟參照文獻(xiàn)［5］。細(xì)胞核棕黃（褐）色為陽(yáng)性結(jié)果。每組取10個(gè)標(biāo)本，顯微數(shù)碼照相，image-proplus 5.0軟件計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)GRP78蛋白的表達(dá)取回腸組織4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片，免疫組化操作步驟參考說(shuō)明書(shū)。每組取10個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本3張切片，顯微數(shù)碼照相，image-proplus5.0軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAP大鼠模型制備結(jié)果肉眼可見(jiàn)SAP組和大黃素組大鼠胰腺形態(tài)輪廓不規(guī)則，局部彌漫性水腫，被膜下可見(jiàn)出血斑，部分大鼠腹腔內(nèi)可見(jiàn)血性腹水。SAP組和大黃素組大鼠胰腺組織切片可見(jiàn)胰腺大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，充填于腺泡之間，間質(zhì)內(nèi)部分血管壁壞死、出血，腺泡數(shù)量減少、雜亂，證明SAP大鼠模型制備成功，見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)各組回腸黏膜細(xì)胞都存在凋亡，見(jiàn)圖2。3組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.794，P＜0.05），與假手術(shù)組（8.10%±1.62%）相比，SAP組（23.14%±3.56%）大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.05）。大黃素組（12.35%±4.32%）較SAP組黏膜細(xì)胞凋亡減少（P＜0.05）。

Fig.2TUNEL assay of ileum section which was counterstained with hematoxylin（DAB，×400）圖2 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠回腸黏膜細(xì)胞凋亡（DAB染色，×400）

2.3 GRP78蛋白表達(dá)GRP78蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞膜上也可見(jiàn)少量表達(dá)，見(jiàn)圖3。3組間陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.841，P＜0.05）。與假手術(shù)組（15.62%±2.25%）相比，SAP組（28.02%±3.24%）腸黏膜細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。大黃素組（25.43%± 3.45%）與SAP組GRP78蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Fig.3Immunohistochemistry staining of GRP78 protein in ileal epithelium sction（DAB，×400）圖3 各組大鼠回腸黏膜細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)（DAB染色，×400）

3 討論

腸道除消化吸收功能外，還對(duì)腸道細(xì)菌及其毒素具有重要的屏障作用。腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、微生物屏障、免疫屏障以及化學(xué)屏障共同構(gòu)成。作為機(jī)體內(nèi)最大的細(xì)菌庫(kù)和毒素庫(kù)，腸黏膜屏障功能破壞后可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能不全。SAP時(shí)不可避免出現(xiàn)腸黏膜通透性增加，黏膜屏障功能受損。

SAP時(shí)腸黏膜屏障功能障礙的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，可能與炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子、微循環(huán)障礙、腸動(dòng)力障礙、免疫功能障礙等因素有關(guān)，而上述因素最終都要通過(guò)作用于腸黏膜細(xì)胞，從而導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷的發(fā)生，腸黏膜細(xì)胞損傷與修復(fù)是SAP時(shí)腸黏膜屏障功能障礙發(fā)生與轉(zhuǎn)歸的核心環(huán)節(jié)。本研究中，SAP大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡較假手術(shù)組明顯增多，與既往的研究一致［3，5］。腸黏膜上皮細(xì)胞增生和凋亡之間的平衡可影響腸黏膜屏障功能。SAP時(shí)腸上皮細(xì)胞凋亡過(guò)度，修復(fù)與再生受阻，可造成腸黏膜屏障功能障礙。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，給予大黃素干預(yù)后SAP大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡明顯減少。大黃是臨床中用于SAP腸道衰竭的常用藥物，并有較好的腸道保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示大黃素可通過(guò)減少腸黏膜細(xì)胞凋亡來(lái)起到保護(hù)SAP時(shí)的腸道損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的十分重要的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑之一［6］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要細(xì)胞器，調(diào)控細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)等。細(xì)胞受到環(huán)境毒物、缺氧、病毒、紫外線(xiàn)等刺激時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)的腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊、未折疊蛋白聚集以及Ca2+平衡紊亂等，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，稱(chēng)為ERS。ERS可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生一系列生理變化，處理蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白，從而維持細(xì)胞的正常功能。但是過(guò)度的ERS可引起細(xì)胞凋亡，ERS信號(hào)由促生存向促凋亡轉(zhuǎn)換。GRP78屬于熱休克蛋白（HSP70）家族，是ERS的主要調(diào)節(jié)器。GRP78通過(guò)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜3種跨膜蛋白解離與結(jié)合來(lái)啟動(dòng)或關(guān)閉ERS，因此GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的中心調(diào)節(jié)者決定著細(xì)胞“生存”或“死亡”的命運(yùn)［7］。GRP78的過(guò)表達(dá)常提示ERS的發(fā)生，并且對(duì)ERS信號(hào)傳導(dǎo)起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SAP組大鼠腸黏膜細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)增加，提示SAP大鼠腸黏膜細(xì)胞存在ERS。但是與筆者預(yù)期不同的是，給予了大黃素治療的SAP大鼠腸黏膜細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)與SAP組相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示大黃素對(duì)ERS并無(wú)調(diào)節(jié)作用。因此推測(cè)大黃素減少SAP大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的作用似乎并不依賴(lài)ERS途徑。

綜上所述，腸黏膜細(xì)胞凋亡增加參與了SAP腸黏膜屏障功能障礙。大黃素可減少SAP時(shí)的腸黏膜細(xì)胞凋亡，保護(hù)腸黏膜屏障。大黃素的這種腸道保護(hù)作用似乎與ERS途徑無(wú)關(guān)，尚需進(jìn)一步探索其他保護(hù)機(jī)制，為大黃在臨床治療SAP腸功能障礙提供更堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2015-04-08收稿 2015-08-06修回）

（本文編輯 魏杰）

Protective roles of Emodin in the intestinal mucosal layer of rats with severe acute pancreatitis

CHEN Xia1，ZHAO Hongxian2，WANG Qiaozhi2，LI Changping1
1 Department of Gastroenterology of Affiliated hospital，Luzhou 646000，China；2 Department of Histology and Embryology，Sichuan Medical University

ObjectiveTo explore the protective roles of Emodin in the intestinal mucosal lay of rats with severe acute pancreatitis（SAP）and its mechanism.MethodsSD rats（n=30）were divided into 3 groups:sham operation group，SAP group and Emodin group（SAP rats treated with Emodin）.The SAP rat models were established via retrograde injection of 3% sodium taurocholate to pancreatic duct.Rats in Emodin group were peritoneally injected with Emodin（2.5 mg/100 g）at both 1 hour and 3 hour after sodium taurocholate injection.Apoptosis of intestinal epithelial cell was detected by TUNEL analysis.The expression of glucose-regulated protein78（GRP78）protein was assessed by immunohistochemistry.ResultsCompared with sham operation group，apoptosis in intestinal epithelial cells and the expression of GRP78 protein were increased significantly in SAP group（P＜0.05）.Emodin treatment reduced AP-induced mucosal intestinal epithelial cell apoptosis（P＜0.05）.But there is no significant difference of GRP78 expression between SAP group and Emodin group（P＞0.05）. ConclusionEmodin has a protective effect on intestinal layer in rats with SAP through inhibiting intestinal epithelial cell apoptosis.However，ER stress is not likely to be involved in this protective effect.

pancreatitis，acute necrotizing；acute disease；intestinal mucosa；Emodin；apoptosis；rats，Sprague-Dawley；severe acute pancreatitis；glucose-regulated protein78

R576.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.014

四川省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（130369）

1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編646000）；2四川醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室

陳霞（1978），女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腸黏膜屏障方面研究