孫紀三，張建軍，高偉，楊濤，郭慶軍，馬楠，王洪海，蔣文濤

肝細胞癌組織HBXIP和GRIM-19表達及意義的探討

孫紀三，張建軍，高偉，楊濤，郭慶軍，馬楠，王洪海，蔣文濤△

目的探討乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白HBXIP和細胞凋亡調(diào)節(jié)因子GRIM-19在肝細胞癌組織中的表達及意義。方法收集42例肝細胞癌組織和28例正常肝臟組織，采用免疫組織化學法檢測兩種組織中HBXIP和GRIM-19的表達。結(jié)果在肝細胞癌組織和正常肝臟組織中，HBXIP陽性表達率分別為80.95%（34/42）和42.86%（12/28）；而GRIM-19陽性表達率分別為40.48%（17/42）和75.00%（21/28），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。肝細胞癌組織中HBXIP的陽性表達率在低、未分化和Ⅲ～Ⅳ期的表達水平高于高、中分化和Ⅰ～Ⅱ期組織；而GRIM-19的陽性表達率與之相反，且無門脈癌栓組織中GRIM-19的陽性表達率高于有門脈癌栓組織。HBXIP與GRIM-19表達呈負相關(guān)（rs=-0.400，P＜0.01）。結(jié)論HBXIP和GRIM-19的異常表達可能與肝細胞癌的發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

癌，肝細胞；腫瘤轉(zhuǎn)移；免疫組織化學；乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白；GRIM-19

長期的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染容易導致原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生［1］。研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）可誘導細胞凋亡，參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展［2］。乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白（hepatitis B virus X-interactingprotein，HBXIP）是由91個氨基酸組成的蛋白，具有重要的生物活性［3］；HBXIP可與HBx的C端特異性結(jié)合，降低HBx的活性［4］；而細胞凋亡調(diào)節(jié)基因19（genes associated with retinoid interferon induced mortality 19，GRIM-19）是一種調(diào)亡基因，受維甲酸和干擾素的共同誘導［5］。但HBXIP和GRIM-19在HCC中的表達、分布及兩者在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用尚鮮見報道。本文采用免疫組織化學法檢測人肝細胞癌組織中HBXIP和GRIM-19蛋白的表達，以探討HBXIP和GRIM-19在肝細胞癌組織中的表達與腫瘤的生成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2011年1月—2013年9月天津市第一中心醫(yī)院接受HCC手術(shù)治療患者術(shù)后存檔的石蠟標本42例，年齡31～73歲，平均（50.7±17.5）歲，均經(jīng)我院病理科確診，且病史資料完整，術(shù)前均未行放療、化療及生物劑治療。組織學分級按2003年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國腫瘤聯(lián)合會（AJCC）聯(lián)合制定的TNM分期法，高、中分化29例，低、未分化13例；TNM分期按2010年美國癌癥研究聯(lián)合會癌癥分期手冊第7版標準，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期27例；有門靜脈血栓14例，無門靜脈血栓28例。所有患者均有完整臨床資料。另取同時期正常肝臟存檔石蠟標本28例。

1.2 主要試劑HBXIP鼠抗人抗體和GRIM-19鼠抗人抗體均為美國Sigma公司產(chǎn)品，工作濃度均為1∶200；SP-0023免疫組化試劑盒（美國ZYMED公司）；DAB顯色試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）。其他試劑均為分析純。

1.3 方法收集病理科登記的HCC患者及肝臟正常的患者的臨床資料與存檔肝臟石蠟標本，統(tǒng)計HCC病因、甲胎蛋白（AFP）水平、腫瘤大小、門靜脈癌栓情況、組織分型、TMN分期等臨床病理學參數(shù)。每例蠟塊4μm厚連續(xù)切片3張，其中1張進行HE染色，另2張進行免疫組化染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，微波抗原修復15 min，3%H2O2室溫孵育。加封閉血清，滴加一抗，4℃過夜，滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色。蘇木素復染2 min，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定選用試劑盒中的陽性片作為陽性對照，PBS取代一抗作為陰性對照。HBXIP、GRIM-19表達于細胞質(zhì)，染色呈棕黃色視為陽性。每張切片隨機讀取5個高倍視野（×200），每個視野計數(shù)100個細胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強度和陽性細胞百分率判斷染色結(jié)果［6-7］。所有切片均由2位病理科醫(yī)師在雙盲情況下獨立觀察判斷，對判斷不一致的病例，共同進行觀察后得出一致結(jié)論。

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用例表示，樣本率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.12 組肝臟組織中HBXIP的表達與分布HBXIP染色主要定位于細胞質(zhì)，在癌細胞中可見大量棕黃色染色，在正常肝細胞中呈弱陽性表達，見圖1。肝癌組織HBXIP的陽性表達率高于正常肝組織（P＜0.01），見表1。

Fig.1The expression of HBXIP in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma（IHC，×200）圖1 HBXIP在正常肝臟組織和肝細胞癌組織中的表達（IHC，×200）

Tab.1The expression of HBXIP in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma表1 HBXIP在正常肝臟組織和肝細胞癌組織中的表達

2.22 組肝臟組織中GRIM-19的表達與分布GRIM-19染色主要定位于細胞質(zhì)，見圖2。在肝細胞癌組織的陽性表達率低于正常肝組織（P＜0.01），見表2。

Fig.2The expression of GRIM-19 in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma（IHC，×200）圖2 GRIM-19在正常肝臟組織和肝細胞癌組織中的表達（IHC，×200）

2.3 HBXIP和GRIM-19在不同臨床特征下陽性表達率比較HBXIP在低、未分化肝癌中的陽性率明

顯高于高、中分化者，Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織中HBXIP的陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期；而HBXIP在HCC病因、門靜脈栓塞情況、AFP水平、腫瘤大小等方面的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。GRIM-19在高、中分化肝癌中的陽性率高于低、未分化者；Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織中HBXIP的陽性表達率率高于Ⅲ～Ⅳ期；無門靜脈栓塞者的陽性率高于有門靜脈栓塞者；而在HCC病因、AFP水平、腫瘤大小等方面陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

Tab.2The expression of GRIM-19 in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma表2 GRIM-19在正常肝臟組織和肝細胞癌組織中的表達

Tab.3Correlation between expressions of HBXIP and GRIM-19 with pathological features in hepatocellular carcinoma表3 肝細胞癌中HBXIP與GRIM-19陽性表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系例（%）

2.4 HBXIP和GRIM-19在肝細胞癌中表達的關(guān)系HBXIP和GRIM-19兩種蛋白在肝細胞癌中的陽性表達呈負相關(guān)（P＜0.01），見表4。

Tab.4Relationship of HBXIP and GRIM-19 expression in hepatocellular carcinoma表4 HBXIP和GRIM-19在肝細胞癌中表達的關(guān)系（例）

3 討論

3.1 HBXIP在腫瘤中的作用HBXIP基因定位于人染色體1p13.3，其表達的蛋白首次于肝癌細胞株HepG2中被發(fā)現(xiàn)，為乙肝病毒編碼的蛋白HBx的相互作用的因子。研究發(fā)現(xiàn)，HBXIP為具有多功能的調(diào)節(jié)蛋白，可通過不同的分子途徑發(fā)揮調(diào)控作用［8］。HBXIP可與凋亡抑制因子survivin形成復合物，同時結(jié)合pro-caspase-9，使survivin通過細胞色素C介導的凋亡途徑抑制細胞凋亡，從而使得HBXIP對肝癌細胞的增殖具有促進作用，因此推測HBXIP與肝細胞癌的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)［9］。為了進一步闡明其分子機制，王鳳澤等［4］通過基因共轉(zhuǎn)染將核因子（NF）-κB報告基因質(zhì)粒pNF-κB-Luc和HBXIP真核表達載體pcDNA3-hbxip導入人肝癌H7402細胞系中，進行熒光素酶活性分析，研究顯示HBXIP可增加細胞核內(nèi)NF-κB蛋白水平，進而發(fā)揮NF-κB促轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。因此，HBXIP可通過調(diào)控NF-κB信號途徑而促進肝癌細胞增殖；同時有研究發(fā)現(xiàn)HBXIP在乳腺癌細胞中過表達［10］，HBXIP通過轉(zhuǎn)錄因子Spl激活Skp2的啟動子活性［11］，上調(diào)S期激酶相關(guān)蛋白（Skp2）、乳腺腫瘤自身抗原（LMO4）的表達，而HBXIP通過上調(diào)Skp2、LMO4可促進乳腺癌癌細胞的遷移［12］。

3.2 GRIM-19蛋白在腫瘤中的作用GRIM-19是GRIM家族一員，其定位于19p13.2，它包含著一個開放讀碼框，其編碼的蛋白質(zhì)含有144個氨基酸殘基。GRIM-19主要定位于胞質(zhì)中的線粒體內(nèi)膜上，在受到外界刺激后表達量增多，并能從線粒體中釋放而進入細胞核。GRIM-19被認為是一種調(diào)亡基因，受維甲酸和干擾素的共同誘導［13］；同時GRIM-19為線粒體中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶Ⅰ復合物的亞單位，在線粒體Ⅰ型呼吸過程中起著至關(guān)重要的作用。多項研究表明，GRIM-19參與細胞的增殖、凋亡的調(diào)控過程［14］，其表達降低或位點突變可以導致細胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［15］，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［5，16］。

3.3 HBXIP與GRIM-19蛋白在肝細胞癌組織和正常肝臟組織中的表達本研究顯示，HBXIP在正常肝組織表達水平較低，而在肝細胞癌組織中呈過量表達，兩組相比具有明顯的差異性；而GRIM-19在肝細胞癌組織中的表達水平相對正常肝組織明顯減少。通過統(tǒng)計肝細胞癌中HBXIP和GRIM-19表達與臨床病理學特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肝細胞癌細胞分化程度越高，HBXIP陽性表達率越低；Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織中HBXIP的表達水平比Ⅲ～Ⅳ期低；有門靜脈癌栓肝癌組織中的陽性率與無門靜脈栓塞者無差異；而GRIM-19在低、未分化、Ⅲ～Ⅳ期、有門靜脈栓塞肝癌組表達均降低，且2種蛋白在AFP水平、腫瘤大小等方面的表達無差異。本研究提示HBXIP、GRIM-19在肝細胞癌組織中的異常表達可能與肝癌細胞發(fā)生、進展，以及腫瘤向周圍組織的侵襲、遷移之間有著高度的關(guān)聯(lián)性，從而為癌細胞轉(zhuǎn)移的研究提供理論依據(jù)。此外，本研究顯示2種蛋白在肝細胞癌中的表達呈負相關(guān)，因此推測HBXIP蛋白表達增加和GRIM-19表達減少在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中存在拮抗作用。

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（2015-05-08收稿 2015-08-08修回）

（本文編輯 李鵬）

Expressions of HBXIP and GRIM-19 in hepatocellular carcinoma and their clinic significance

SUN Jisan，ZHANG Jianjun，GAO Wei，YANG Tao，GUO Qingjun，MA Nan，WANG Honghai，JIANG Wentao△
Tianjin First Central Hospital of Oriental OrganTransplant Center，Tianjin 300192，China△

ObjectiveTo investigate the expressions of HBXIP and GRIM-19 in hepatocellular carcinoma tissues and their clinic significance.MethodsHepatocellular carcinoma tissue（n=42）and normal liver tissue（n=28）were collected from Tianjin First Central Hospital，immunohistochemistry was used to detect the expressions of HBXIP and GRIM-19 in these two groups.ResultsRate of cells with positive expressions of HBXIP in hepatocellular carcinoma and normal liver tissues were 80.95%（34/42）and 42.86%（12/28）respectively；Rate of cells with positive expression of GRIM-19 in hepatocellular carcinoma tissues and normal liver tissues was 40.48%（17/42）and 75.00%（21/28）respectively，and the difference between these two groups was statistically significant（P＜0.05）；The expression of HBXIP was higher but the expression of GRIM-19 was lower in poor differentiated and stageⅢ-IV cells than those in well and moderate differentiated cells and in stage I-II，cells.What′s more，the expression of GRIM-19 is higher in tissue without portal thrombosis than that in tissue with portal thrombosis.The expression of HBXIP was negatively correlated with GRIM-19 expression（rS=-0.400，P＜0.01）. ConclusionThe abnormal expressions of HBXIP and GRIM-19 may play important roles in the process of development and metastasis of hepatocellular carcinoma.

carcinoma，hepatocellular；neoplasm metastasis；immunohistochemistry；HBXIP；GRIM-19

R735.7

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.006

天津市科技計劃項目（10ZCGYSF00500）

天津市第一中心醫(yī)院東方器官移植中心（郵編300192）

孫紀三（1980），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事肝臟移植方面研究

△通訊作者E-mail：jiang-wentao@medmail.com.cn