王昌蘭，高志紅，常愛玲，王寶利

miR-320-3p調控脂肪細胞分化的研究

王昌蘭1，2，高志紅2，常愛玲1，2，王寶利1△

目的探討miR-320-3p對脂肪細胞分化的影響。方法分離并培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞（MSCs），并對其進行脂肪細胞誘導分化3 d，用qRT-PCR檢測miR-320-3p在成脂分化過程中的表達水平。在骨髓基質細胞系ST2中轉染miR-320-3p，對其進行成脂方向誘導分化，用油紅O染色和qRT-PCR檢測miR-320-3p對ST2成脂分化的影響。結果MSCs向脂肪細胞分化過程中miR-320-3p表達增加（P＜0.01）；與轉染陰性對照NC mimics相比，ST2細胞轉染miR-320-3p mimics后油紅O染色顯示脂肪細胞明顯增多，脂肪細胞特異性轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、CCAAT增強子結合蛋白α（C/EBPα）和脂肪細胞脂肪酸結合蛋白4（FABP4）基因表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論miR-320-3p可促進ST2向脂肪細胞分化。

脂細胞；間質干細胞；細胞分化；成脂分化；微RNAs；miR-320-3p

microRNA（miRNA）是一類高度保守、非編碼的RNA，約由22個核苷酸組成，主要通過與靶基因3′-非翻譯區(qū)（UTR）結合，抑制蛋白的翻譯水平。許多研究表明miRNA在間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）及前脂肪細胞向脂肪細胞分化過程中起到重要調節(jié)作用［1］。而miR-320-3p與脂肪細胞分化關系的研究鮮見文獻報道。本研究測定了MSCs向脂肪細胞分化時miR-320-3p的表達水平，

探討miR-320-3p對脂肪細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠ST2細胞由本實驗室保存；轉染試劑Lipofectamine RNAimax為Invitrogen公司產品；miR-320-3p mimics及其陰性對照片段NC mimics為上海吉瑪生物科技公司產品；miRNA提取試劑盒及總RNA提取試劑盒均購自OMEGA公司；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRNA特異性引物購自Gene Copoeia公司；誘導試劑胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自Sigma公司；吲哚美辛為Cyagen公司產品。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離培養(yǎng)及分組通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離小鼠骨髓間充質干細胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞融合度在80%以上時傳代。在實驗前24 h將MSCs接種于12孔板中，分為分化組與對照組，待細胞融合度達100%時對分化組進行成脂分化誘導3 d，對照組采用溶媒處理。誘導試劑包含0.05 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5 mg/L胰島素、0.05 mmol/L吲哚美辛和0.05 μmol/L地塞米松。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-320-3p表達水平將MSCs成脂誘導3 d后回收細胞，按照OMEGA miRNA kit說明書分別提取細胞miRNA并采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄為cDNA。用SYBR Green qPCR試劑分別進行miR-320-3p和U6（內參）的qRT-PCR擴增，上游引物：miR-320-3p-F 5′-CAAAAGCTGGGTTGAGAGGG-3′；U6-F 5′-TTCGTGAAGCGTTCCATATT-3′，下游引物為試劑盒自帶。PCR反應總體積為20 μL，反應體系為3 μL cDNA，上、下游引物終濃度為400 nmol/L，SYBR Green qPCR mix 10 μL，用去離子水補充至20 μL體系。反應條件為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸15 s，進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算分化組目的基因相對于對照組的表達量，CT值指每個反應管內的熒光信號到達一定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；樣品△CT=目的基因CT值–U6 CT值，所有實驗重復3次以上。

1.2.3 ST2細胞的轉染及分組用含5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，實驗前將ST2細胞接種于12孔板中，按照Lipofectamine RNAimax轉染試劑說明書，分別轉染miR-320-3p mimics、NC mimics。轉染20 h后更換新鮮α-MEM完全培養(yǎng)基，誘導方法同1.2.1。

1.2.4 油紅O染色觀察miR-320-3p mimics轉染組與NC mimics轉染組脂肪細胞分化情況待脂滴成熟后棄細胞培養(yǎng)基，PBS洗2次；4%多聚甲醛固定20 min；棄去固定液，加入PBS洗1次，棄液；加入60%異丙醇，室溫放置1～2 min，棄液；加入60%油紅O染液，染色5 min，蒸餾水漂洗干凈，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 qRT-PCR檢測脂肪細胞轉錄因子和表征基因的表達水平miR-320-3p mimics及其對照NC mimics轉染ST2細胞后，于成脂誘導后48 h收獲細胞，按照OMEGA總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用Gene Copoeia逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。qRT-PCR檢測脂肪細胞特異性轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、CCAAT增強子結合蛋白α（C/EBPα）及表征基因脂肪細胞脂肪酸結合蛋白4（FABP4）相對于β-actin（內參）的表達量，引物序列如下：β-actin上游5′-AAGACCTCTATGCCAACACAG-3′，下游5′-GGAGGAGCAATGATCTTGATC-3′；C/EBPα上游5′-CTGATTCTTGCCAAACTGAG-3′，下游5′-GAGGAAGCTAAGACCCACTAC-3′；FABP4上游5′-AAATCACCGCAGA CGACAGG-3′，下游5′-GGCTCATGCCCTTTCATAAAC-3′；PPARγ上游5′-CTTGACAGGAAAGACAACGG-3′，下游5′-GCTTCTACGGATCGAAACTG-3′。PCR反應總體積為20 μL，反應體系為3 μL的cDNA，特異性上、下游引物終濃度為400 nmol/L，SYBR Green qPCR mix 10 μL，用去離子水補足20 μL體系。反應條件及計算方法同1.2.2，所有實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MSCs成脂誘導后miR-320-3p表達MSCs細胞在成脂誘導后miR-320-3p的表達明顯增加，其表達量在分化組（3.70±0.26）較對照組（1.00±0.15）增加2.7倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=15.430，P＜0.01）。

2.2 miR-320-3p對脂肪細胞分化的影響ST2細胞轉染miR-320-3p mimics及NC mimics后，經(jīng)油紅O染色，miR-320-3p轉染組較NC mimics轉染組細胞脂滴明顯增多，分化更加成熟，見圖1。

Fig.1The effect of miR-320-3p on adipogenic differentiation in ST2 cell shown by oil red O staining圖1 miR-320-3p對ST2成脂分化的影響（油紅O染色，×200）

2.3 qRT-PCR檢測miR-320-3p mimics對脂肪特異性基因表達的影響ST2細胞轉染miR-320-3p mimics后，成脂特異性基因FABP4、PPARγ以及C/EBPα mRNA明顯增多，分別為NC mimics轉染組的3.33、4.01及5.10倍，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1The effect of miR-320-3p on transcription levels of FABP4，PPARγ and C/EBPα mRNA表1 miR-320-3p mimics對FABP4、PPARγ和C/EBPα mRNA的影響（n=3）

Tab.1The effect of miR-320-3p on transcription levels of FABP4，PPARγ and C/EBPα mRNA表1 miR-320-3p mimics對FABP4、PPARγ和C/EBPα mRNA的影響（n=3）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

C / E B P α 1 . 0 0 ± 0 . 0 9 5 . 1 0 ± 0 . 7 4 9 . 9 5 6＊＊組別N C m i m i c s轉染組m i R -3 2 0 -3 p m i m i c s轉染組t F A B P 4 1 . 0 0 ± 0 . 1 9 3 . 3 3 ± 0 . 8 2 4 . 1 9 5＊P P A R γ 1 . 0 0 ± 0 . 3 0 4 . 0 1 ± 0 . 3 2 1 0 . 9 5 2＊＊

3 討論

骨髓來源的MSCs是一類具有自我更新與多向分化潛能的干細胞，能通過比較簡單的技術從骨髓中分離和純化，體外擴增多代仍保持其干細胞的分化潛能。骨髓來源的MSCs可以在不同的誘導條件下分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞等［1-2］。miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與轉錄后翻譯的調節(jié)，在細胞分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要調節(jié)作用。2003年Xu等［3］發(fā)現(xiàn)miR-14敲減后的果蠅三酰甘油和二酰甘油的水平增高，自此開始了miRNA調節(jié)脂肪細胞分化的研究。對于miR-320-3p，研究發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病及心臟缺血再灌注中具有重要作用［4-6］。近年來Ling等［7］證實miR-320的反義寡核苷酸可以改善有胰島素抵抗的3T3-L1細胞對胰島素的敏感性，但miR-320-3p對脂肪細胞分化的調控鮮有研究。

本研究中，在MSCs向脂肪細胞分化過程中miR-320-3p升高2.7倍，提示miR-320-3p對MSCs的成脂分化可能具有調節(jié)作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在ST2細胞中轉染miR-320-3p后脂肪細胞分化增多，脂肪細胞特異性轉錄因子PPARγ和C/EBPα及成脂表征基因FABP4的表達都較對照組有明顯升高，證實miR-320-3p能促進脂肪細胞分化。

miRNA可通過與某些脂肪細胞調節(jié)基因的3′-UTR結合而抑制其表達，進而調節(jié)脂肪細胞的分化。如miR-223通過靶向抑制成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)gfr2）的表達促進脂肪細胞分化［8］；miR-17-92通過與視網(wǎng)膜母細胞瘤相關蛋白p130（retinoblastoma-like protein p130，Rb2/p130）的3′-UTR結合抑制Rb/p130的翻譯，促進前脂肪細胞分化成熟［9］；miR-194通過靶向減少雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ（chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factorⅡ，COUP-TFⅡ）的表達抑制脂肪細胞的分化［10］；miR-139-5p則靶向抑制Notch和胰島素受體底物1（IRS1）而抑制脂肪細胞分化［11］。然而，關于miR-320-3p誘導脂肪細胞分化的機制還不清楚。

脂肪細胞分化及其調控失常與人類多種疾病如肥胖癥、糖尿病、脂肪肝、高脂血癥及骨質疏松等密切相關［12］。新近有研究發(fā)現(xiàn)再生障礙性貧血的發(fā)病也可能與異常免疫誘導骨髓間充質干細胞的過度脂肪化有關［13］。因而研究miRNA對脂肪細胞分化的調控作用及其機制可能對此類疾病的防治有重要指導意義，可為疾病治療提供新的靶點。

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（2015-05-21收稿 2015-08-05修回）

（本文編輯 李國琪）

The impact of miR-320-3p on adipocyte differentiation

WANG Changlan1，2，GAO Zhihong2，CHANG Ailing1，2，WANG Baoli1△
1 Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Endocrinology，General Hospital of Tianjin Medical University△

ObjectiveTo study the role of miR-320-3p in adipocyte differentiation.MethodsMarrow mesenchymal stem cells were isolated from mice and cultured then induced with adipogenic agents for 3 days.The transcription level of miR-320-3p was examined by qRT-PCR.Stromal ST2 cells were transfected with miR-320-3p，followed by adipogenic treatment.Oil-red O staining and qRT-PCR were employed to assess the differentiation of adipocytes induced by miR-320-3p.ResultsThe expression level of miR-320-3p increased in MSCs after adipogenic treatment（P＜0.01）.Addition of miR-320-3p in ST2 cells promoted the formation of oil-red O positive adipocytes and up-regulated the expression levels of adipogenic transcription factors such as peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ），CCAAT/enhancer binding protein-α（C/EBPα）and the marker gene adipocyte fatty acid binding protein 4（FABP4），compared to cells that transfected with miR-320-3p mimics（P＜0.05）.ConclusionmiR-320-3p promotes ST2 cells differentiation into adipocytes.

adipocytes；mesenchymal stem cells；cell differentiation；adipogenesis；microRNAs；miR-320-3p

R34

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.003

國家自然科學基金資助項目（81271977，81472040）

1天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內分泌研究所，衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院內分泌科

王昌蘭（1987），女，碩士，主要從事基因分子生物學研究

△通訊作者E-mail：bliwang72@163.com