王海曉，崔壯，王寶利，邊育紅，鄭紡△

細胞與分子生物學

川續(xù)斷皂苷Ⅵ對小鼠骨髓基質(zhì)細胞ST-2成脂分化的影響及其機制研究

王海曉1，崔壯2，王寶利3，邊育紅1，鄭紡1△

目的觀察川續(xù)斷皂苷Ⅵ（AsperosaponinⅥ，ASAⅥ）對脂肪細胞分化的影響及Wnt通路的調(diào)節(jié)。方法以小鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST-2為研究對象，將其分為對照組、成脂分化組以及4個不同劑量的ASAⅥ組。其中對照組加入溶媒，成脂分化組加入成脂誘導分化試劑，ASAⅥ組除加入成脂誘導分化試劑外，使用不同濃度（10-7、10-6、10-5、10-4mol/L）的ASAⅥ干預(yù)細胞。各組細胞處理5 d后，行油紅O染色，觀察脂滴形成情況并計算成脂率進行定量分析；熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測成脂相關(guān)基因PPARγ、FABP4和Wnt/β-連環(huán)素（β-catenin）通路蛋白β-catenin的mRNA表達水平；Wnt通路抑制劑DKK1干預(yù)誘導成脂分化的ST-2細胞5 d，F(xiàn)Q-PCR檢測ASAⅥ所調(diào)節(jié)的PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA表達水平。結(jié)果與成脂分化組相比，10-5mol/L和10-4mol/L ASAⅥ組中分化的脂肪細胞顯著減少，10-5、10-4mol/L ASAⅥ明顯抑制PPARγ、FABP4的mRNA表達，但上調(diào)β-catenin mRNA表達。DKK1能夠逆轉(zhuǎn)ASAⅥ對ST-2細胞成脂分化的抑制作用，促進PPARγ、FABP4的mRNA表達，抑制β-catenin的mRNA表達。結(jié)論ASAⅥ能顯著抑制ST-2細胞的成脂分化，這一作用可能是通過Wnt/β-catenin通路的激活所介導的。

成脂分化；β連環(huán)素；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；骨髓基質(zhì)細胞；Wnt信號通路

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是一種具有多向分化潛能的干細胞，是脂肪細胞和成骨細胞的共同前體。生理狀態(tài)下，BMSCs向脂肪細胞和成骨細胞分化維持相對平衡。某些病理狀態(tài)下，成骨成脂分化平衡被打破，調(diào)控BMSCs向成骨或成脂某一方向分化的作用占優(yōu)勢，往往會削弱其向另一方向分化［1］。續(xù)斷是中醫(yī)臨床上常用的補腎中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷等功效。川續(xù)斷皂苷Ⅵ（AsperosaponinⅥ，ASAⅥ）是續(xù)斷的活性成分，藥典中將其作為續(xù)斷的質(zhì)控標準［2］。體外研究表明，ASAⅥ能夠促進大鼠BMSCs向成骨細胞增殖和分化，該作用可能是通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）蛋白的活性來實現(xiàn)的［3］。然而ASAⅥ對干細胞成脂分化的影響及調(diào)控的信號通路還不十分清楚。本研究以小鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST-2為研究對象，觀察ASAⅥ對ST-2細胞成脂分化的影響，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST-2由天津醫(yī)科大學王寶利研究員惠贈；ASAⅥ購自天津一方科技有限公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松（Dexamethasone，DXM）、胰島素（Insulin，INS）、吲哚美辛（Indometacin，INDO）和油紅O為美國Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國Hyclone公司產(chǎn)品；TRIZOL、定量PCR試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；重組人DKK1蛋白為以色列ProSpec公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST-2的培養(yǎng)與誘導成脂分化復(fù)蘇凍存的小鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST-2，使用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每隔2～3 d換液1次。待細胞融合達80%～90%時，將其傳代培養(yǎng)并誘導成脂分化。具體過程為先使用添加了成脂誘導分化試劑0.25 mmol/L IBMX、0.5 μmol/L DXM、5 mg/L INS、50 μmol/L INDO的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞3 d，再換以僅添加5 mg/L INS的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d。

1.2.2 細胞分組及處理將ST-2細胞分為6組，分別為對照組、成脂分化組和4個不同劑量ASAⅥ組。對照組只加入等體積的溶媒；成脂分化組加入成脂誘導分化試劑進行誘導分化培養(yǎng)（如1.2.1所述）；各ASAⅥ組除加入成脂誘導分化試劑外，分別使用10-7、10-6、10-5、10-4mol/L的ASAⅥ對細胞予以干預(yù)。

1.2.3 油紅O染色檢測脂肪細胞的分化ST-2細胞誘導成脂分化培養(yǎng)5 d后移除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞3次，而后細胞依次使用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗1 min，60%異丙醇浸洗1 min，油紅O染色10 min，蒸餾水漂洗2 min；最后，于倒置顯微鏡下觀察脂肪細胞的生成情況并拍照，計算成脂率（%）=脂肪細胞數(shù)/總細胞數(shù)，定量分析各組脂肪細胞的生成情況。

1.2.4 熒光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，F(xiàn)QPCR）檢測脂肪細胞特異性基因的表達各組細胞誘導成脂分化5 d后，收獲細胞，提取細胞總RNA，具體操作過程依據(jù)TRIZOL試劑說明書進行。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶將2 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA第一鏈。以cDNA為模板，F(xiàn)QPCR檢測脂肪細胞特異性基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferator-Activated receptor-γ，PPARγ）、脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty-acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4）和Wnt通路蛋白β-連環(huán)素（β-catenin）的mRNA表達。FQ-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2×SYBR GREEN PCR Master Mix 10 μL，無RNA酶水補足反應(yīng)體系至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s、58℃退火10 s、72℃延伸10 s，進行35次循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用溶解曲線法分析，以明確樣品擴增的特異性。管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因標準化目的基因的表達。目的基因的相對表達量采用2-??Ct法計算。其中??Ct=（目的基因Ct值-GAPDH Ct值）實驗組-（目的基因Ct值-GAPDH Ct值）對照組。引物序列見表1。

Tab.1Primer sequence of genes that were amplified by FQ-PCR表1 FQ-PCR檢測的基因引物序列

1.2.5 Wnt通路抑制劑DKK1對ASAⅥ抑制的脂肪細胞分化的影響采用Wnt通路抑制劑DKK1（0.3 mg/L）預(yù)處理誘導成脂分化的ST-2細胞1 h，而后再加入10-4mol/L的ASAⅥ繼續(xù)干預(yù)細胞5 d。收獲細胞，提取總RNA，F(xiàn)Q-PCR檢測脂肪細胞特異性基因PPARγ、FABP4和Wnt通路蛋白βcatenin的mRNA表達。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ASAⅥ對ST-2細胞成脂分化的影響對照組

ST-2細胞中僅有（4.531±0.922）%細胞分化成脂肪細胞，成脂分化組中可見（83.074±1.013）%細胞分化為脂肪細胞；10-7、10-6、10-5和10-4mol/L ASAⅥ組的成脂率分別為（76.908±2.372）%、（70.323±3.541）%、（53.258±2.049）%、（42.293±2.774）%（n=6，F(xiàn)= 951.514，P＜0.01），隨ASAⅥ濃度增加，成脂率依次降低（P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

2.2 ASAⅥ對PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA表達的影響與對照組比較，成脂分化組的PPARγ、FABP4 mRNA表達顯著升高，約為對照組的7.9倍和8.3倍，而β-catenin的mRNA水平明顯降低，約為對照組的41%。ASAⅥ干預(yù)后，10-5、10-4mol/L ASAⅥ明顯抑制PPARγ、FABP4的mRNA表達，但明顯上調(diào)β-catenin的mRNA表達。與成脂分化組比較，10-5、10-4mol/LASAⅥ對PPARγ mRNA的抑制率分別為37.8%和45.1%；對FABP4 mRNA的抑制率分別為45.0%和57.2%；10-5、10-4mol/L ASAⅥ組β-catenin mRNA表達水平分別為成脂分化組的2.88和3.54倍。見表2。

Tab.2Relative transcription levels of PPARγ，F(xiàn)ABP4 and β-catenin in differentiated ST-2 adipocyte表2 ASAⅥ對誘導成脂分化的ST-2細胞中PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA的相對表達水平（n=6，）

Tab.2Relative transcription levels of PPARγ，F(xiàn)ABP4 and β-catenin in differentiated ST-2 adipocyte表2 ASAⅥ對誘導成脂分化的ST-2細胞中PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA的相對表達水平（n=6，）

＊＊P＜0.01；將對照組設(shè)定為1，a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.05

β -c a t e n i n 1 . 0 0 ± 0 . 1 9 0 . 4 1 ± 0 . 0 7 a 0 . 4 9 ± 0 . 0 9 a 0 . 5 7 ± 0 . 0 6 a b 1 . 1 8 ± 0 . 1 9 a b cd1 . 4 5 ± 0 . 2 3 a b cd4 5 . 3 7 5＊＊組別對照組（1）成脂分化組（2）1 0 -7 m o l / L A S AⅥ組（3）1 0 -6 m o l / L A S AⅥ組（4）1 0 -5 m o l / L A S AⅥ組（5）1 0 -4 m o l / L A S AⅥ組（6）F P P A R γ 1 . 0 0 ± 0 . 1 2 7 . 9 1 ± 1 . 0 5 a 7 . 3 5 ± 1 . 2 8 a 7 . 2 1 ± 1 . 0 4 a 4 . 9 2 ± 0 . 7 9 a b c d 4 . 3 4 ± 0 . 6 6 a b c d 5 0 . 1 0 4＊＊F A B P 4 1 . 0 0 ± 0 . 2 7 8 . 3 2 ± 1 . 3 9 a 7 . 8 5 ± 1 . 2 1 a 7 . 6 1 ± 1 . 0 7 a 4 . 5 8 ± 0 . 8 3 a b c d 3 . 5 6 ± 0 . 7 6 a b c d 5 2 . 3 8 6＊＊

2.3 Wnt通路抑制劑減弱ASAⅥ對脂肪細胞分化的抑制作用選擇抑制作用最明顯的10-4mol/L ASAⅥ開展進一步實驗。Wnt通路抑制劑DKK1能夠逆轉(zhuǎn)ASAⅥ對脂肪細胞分化的抑制作用。與10-4mol/L ASAⅥ組相比，DKK1組PPARγ、FABP4的mRNA表達水平顯著增加，分別為ASAⅥ組的1.61和2.04倍；而β-catenin mRNA的表達水平明顯降低，約為ASAⅥ組的52.8%。見表3。

Tab.3Effect of DKK1 on transcription levels of PPARγ，F(xiàn)ABP4 and β-catenin that were regulated by ASAⅥ表3 Wnt通路抑制劑DKK1對ASAⅥ調(diào)節(jié)的PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA表達的影響（n=6，）

Tab.3Effect of DKK1 on transcription levels of PPARγ，F(xiàn)ABP4 and β-catenin that were regulated by ASAⅥ表3 Wnt通路抑制劑DKK1對ASAⅥ調(diào)節(jié)的PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA表達的影響（n=6，）

＊＊P＜0.01；將成脂分化組設(shè)定為1，a與（1）組比較，b與（2）組比較，P＜0.05

組別成脂分化組（1）1 0 -4 m o l / L A S AⅥ組（2）D K K 1干預(yù)組（3）F P P A R γ 1 . 0 0 ± 0 . 2 2 0 . 5 7 ± 0 . 2 1 a 0 . 9 2 ± 0 . 1 8 b 7 . 5 3 7＊＊F A B P 4 1 . 0 0 ± 0 . 1 3 0 . 4 8 ± 0 . 0 9 a 0 . 9 8 ± 0 . 1 7 b 2 7 . 2 2 0＊＊β -c a t e n i n 1 . 0 0 ± 0 . 1 4 2 . 6 3 ± 0 . 2 5 a 1 . 3 9 ± 0 . 2 7 a b 8 4 . 1 2 8＊＊

3 討論

3.1 BMSCs成骨成脂分化平衡及其調(diào)控脂肪細胞是哺乳動物體內(nèi)一類重要的功能細胞，在維持脂類代謝與能量平衡方面具有關(guān)鍵作用。脂肪細胞和成骨細胞共同起源于BMSCs，兩者的分化存在“此消彼長”的動態(tài)平衡，如在各類骨丟失性疾病的發(fā)生過程中，骨量的減少往往伴隨著骨髓中脂肪細胞的增多。BMSCs分化為成熟脂肪細胞受到許多轉(zhuǎn)錄因子如PPARγ和FABP4等和信號通路的調(diào)節(jié)。PPARγ屬于核激素受體超家族，是一類依賴配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著不可或缺的作用［4］。研究表明，BMSCs中的PPARγ活化后抑制成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子a1（core binding factor a1，Cbfa1）和Osterix等的表達，阻礙成骨細胞分化并加強脂肪細胞分化，促進脂肪組織生成；反之，若PPARγ基因發(fā)生突變，則脂肪細胞分化削弱，而成骨細胞分化加強，進而促進骨形成［5］。FABP4基因也稱為aP2，屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族，是脂肪細胞分化成熟的標志基因，廣泛參與了脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運及代謝過程［6］。經(jīng)典Wnt信號途徑，亦稱Wnt/β-catenin信號途徑，是調(diào)控脂肪細胞分化的分子開關(guān)。體內(nèi)、外研究均表明Wnt通路能夠抑制脂肪細胞的分化［7］。

3.2 ASAⅥ對成骨成脂分化的影響續(xù)斷，又名和尚頭，為川續(xù)斷科多年生草本植物川續(xù)斷的根，因能“續(xù)折接骨”而得名。續(xù)斷在中醫(yī)臨床主要用于腰膝酸軟、跌撲損傷、風濕痹痛、崩漏、胎漏等的治療。現(xiàn)代研究認為續(xù)斷的主要活性成分ASAⅥ能夠促進大鼠BMSCs的增殖和骨向分化，提高成骨細胞的活性和數(shù)量。此外，陳小宇等［8］研究表明，ASAⅥ能夠以劑量依賴的方式抑制3T3-L1前脂肪細胞的成脂分化。這些研究提示ASAⅥ可通過改善成骨成脂分化平衡失調(diào)來發(fā)揮其防治骨質(zhì)疏松、促進骨折愈合的功效。然而目前尚鮮見關(guān)于ASAⅥ對干細胞成脂分化的影響及作用機制的報道。因此，筆者在本文中進行了ASAⅥ對骨髓基質(zhì)細胞ST-2成脂分化的機制研究。

本研究中，在成脂誘導分化試劑作用下，成脂分化組的PPARγ和FABP4的基因表達水平與對照組相比顯著升高，ASAⅥ處理后PPARγ、FABP4的mRNA表達水平急劇減低。油紅O染色結(jié)果也印證了基因表達的結(jié)果，即成脂誘導分化試劑作用下骨髓基質(zhì)細胞ST-2分化為含大量脂滴的脂肪細胞，而ASAⅥ干預(yù)后，脂肪細胞的生成明顯受到抑制。ASAⅥ干預(yù)后，誘導成脂分化的ST-2細胞中的β-catenin mRNA表達水平明顯升高；而Wnt通路抑制劑DKK1作用后，能夠下調(diào)ASAⅥ促進的βcatenin mRNA表達并上調(diào)ASAⅥ抑制的PPARγ、FABP4 mRNA表達，表明DKK1在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)ASAⅥ對ST-2細胞成脂分化的抑制作用，這一結(jié)果也說明Wnt/β-catenin通路的激活介導了ASAⅥ對脂肪細胞分化的抑制作用。

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（2015-07-06收稿 2015-08-31修回）

（本文編輯 李鵬）

Effect of AsperosaponinⅥon adipocyte differentiation in ST-2 cells and its underlying mechanisms

WANG Haixiao1，CUI Zhuang2，WANG Baoli3，BIAN Yuhong1，ZHENG Fang1△
1 College of Integrated Traditional and Western Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2 College of Public Health，Tianjin Medical University；3 Key Laboratory of Hormone and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University△

ObjectiveThe effect of AsperosaponinⅥ（ASAⅥ）on adipocyte differentiation and the involvement of Wnt signal pathway was investigated.MethodsThe murine bone marrow stromal cell line ST-2 were divided into 6 groups:control group，adipocyte differentiation group，and 4 different doses of ASAⅥgroups.Control group was exposed to the vehicle，adipocyte differentiation group was exposed to adipogenic reagent，and those 4 ASAⅥgroups were treated with different concentration（10-7，10-6，10-5，10-4mol/L）of ASAⅥafter adipocyte differentiation induction.5 days later，oil red O staining was performed to calculate adipocyte rate.Then mRNA transcription levels of PPARγ，F(xiàn)ABP4 genes and β-catenin that were Wnt/β-catenin signaling pathway proteins were examined by FQ-PCR.Then Wnt pathway inhibitor DKK1 was supplemented into ST-2 cells treated with 10-4mol/L ASAⅥfor 5 days.After that FQ-PCR was used to detect whether transcription levels of PPARγ，F(xiàn)ABP4 and β-catenin in ST-2 cells were changed.ResultsCompared with adipocyte differentiation group 10-5mol/L and 10-4mol/L ASAⅥtreatments greatly down-regulated the number of lipid droplets and markedly inhibited transcription levels of adipocyte characterization transcription factors included PPARγ，F(xiàn)ABP4 while up-regulated transcription level of β-catenin in ST-2 cells.DKK1 can reverse the inhibitory effect of ASAⅥon adipocyte differentiation in ST-2 adipocyte.The transcription levels of PPARγ and FABP4 were up-regulated significantly while transcription level of β-catenin was inhibited.ConclusionASAⅥblocks adipocyte differentiation in ST-2 cells which might be mediated through activating Wnt/β-catenin signaling pathway.

adipocyte differentitation；beta catenin；AsperosaponinⅥ；bone marrow stromal cells；Wnt signal pathway

R285.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.001

國家自然科學基金資助項目（81102543，81200611）；中國博士后基金面上項目（2012M520588）

1天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院（郵編300193）；2天津醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院；3天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所

王海曉（1989），男，碩士在讀，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治代謝性骨病方面的研究

△通訊作者E-mail：zhengfang_1979@163.com