顧厚武，何寬信，劉再強，徐慶凱，郭家明，陳學(xué)平

1 江西省煙草公司，江西南昌洪城路298號330025；2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，安徽合肥徽州大道1129號 230052

TMV侵染后煙草中信號分子水楊酸和過氧化氫的變化

顧厚武1，何寬信1，劉再強1，徐慶凱1，郭家明2，陳學(xué)平2

1 江西省煙草公司，江西南昌洪城路298號330025；2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，安徽合肥徽州大道1129號 230052

以兩個抗病品種、一個感病品種為材料，利用抗體和定位染色對TMV侵染后煙草中的信號分子水楊酸和過氧化氫的時空變化進行檢測。結(jié)果表明：接種TMV能夠誘導(dǎo)水楊酸（SA）含量的上升，到接種后12h達到最大，且接種葉比同側(cè)上部葉上升幅度要大，品種間存在差異；抗病品種接種TMV能夠誘導(dǎo)過氧化氫的產(chǎn)生，隨著時間延長過氧化氫從局部向外擴散，而感病品種和磷酸鹽緩沖液（PBS）對照不能激發(fā)過氧化氫的產(chǎn)生。

TMV；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；煙草

植物具有一整套細(xì)胞學(xué)機制去保護自己抵御病原菌的侵襲。在許多情況下寄主識別病原菌激活所謂的超敏反應(yīng)（hypersensitive response, HR），這個超敏反應(yīng)是具有一系列特征的抗性反應(yīng)，如定位細(xì)胞死亡、產(chǎn)生超氧離子和過氧化氫、葡聚糖沉積、細(xì)胞壁增強、次生代謝產(chǎn)物和對微生物具有抗性活性的蛋白質(zhì)的合成[1-3]。HR在表型上存在著差異，從單細(xì)胞HR到擴散型壞死區(qū)域，其主要作用是有效地限制病原菌在宿主體內(nèi)的繁殖、定居及擴散。與這種局部反應(yīng)相關(guān)的是，經(jīng)過幾天到一周時間被侵染的植物產(chǎn)生新的抗性，從而對病原菌的再次侵染甚至其它病菌的感染均具有很強的抗性。這種抗性水平可以擴散到整個植株，通常稱為系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)[4-6]。在實現(xiàn)SAR過程中，水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯、過氧化氫（H2O2）等信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用。不同的作物涉及到不同的信號分子，煙草對TMV系統(tǒng)獲得性抗病性中的信號分子是水楊酸和過氧化氫。雖然已經(jīng)有一些研究報道了這些信號分子的作用[7-10]，但其時空變化以及品種間的差異性未見報道。本研究采用特異抗體和定位化學(xué)方法對病程過程中信號分子水楊酸和過氧化氫進行測定，并分析品種間的差異性，以期在系統(tǒng)獲得性抗病性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理方面作些探索。

1 材料與方法

1.1 參試品種

參試品種包括具有系統(tǒng)獲得性抗病特性的品種Xanthi-nc、HZNH和感病品種K358。

1.2 樣品處理

上述品種常規(guī)方法育苗，煙苗8葉左右移栽到盆缽中，待煙苗12葉左右時，分別在不同煙株的第5葉上，采用涂抹方法沿葉片主脈兩側(cè)接種TMV、進行SA涂抹和PBS涂抹。每品種各處理12株（其中6株用于測定SA、6株用于H2O2的的定位觀察），3次重復(fù)。

水楊酸測定樣品：處理后2h，4h，6h，8h，12h，24h取各處理葉和同側(cè)上部葉0.5g左右剪碎放置在小瓶中，加5mL甲醇并封口，置于零下20℃中保存待測。

過氧化氫定位觀察樣品：TMV接種2h，6h，12h，24h、SA涂抹6h，12h，24h后取各處理葉和同側(cè)上部葉，立即進行定位觀察的相關(guān)處理。

1.3 水楊酸測定和過氧化氫定位觀察方法

水楊酸測定：利用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理組研制的抗體對待測樣品進行SA檢測；

過氧化氫定位觀察：將樣品置于千分之一的DAB溶液中染色4h，而后用70%乙醇脫色數(shù)小時。

2 結(jié)果與分析

對不同品種實施接種TMV、SA涂抹和PBS涂抹后，在不同時間段對處理葉和同側(cè)上部葉進行SA和過氧化氫定位觀察，結(jié)果如下：

2.1 不同處理下信號分子SA的動態(tài)變化

由圖1可見，接種TMV后煙草抗病品種HZNH的接種葉和上部葉的SA含量均呈上升趨勢，在觀測時間段內(nèi)，到12h時達到最大，到24小時時有所下降。其中接種葉比上部葉上升的幅度要大一些，而相應(yīng)沒有接種的對照葉SA含量在幾次取樣中沒有明顯的變化，該差異暗示SA是由TMV接種誘導(dǎo)的。

涂抹SA后，其同側(cè)上部葉SA含量均較對照要高（圖2），其中涂抹6小時后比對照的SA含量差異更加明顯。說明涂抹SA同樣可以誘導(dǎo)同側(cè)上部葉內(nèi)源SA含量的增加。而對照的同側(cè)上部葉SA含量基本無變化。

圖1 TMV接種對HZNH品種煙草下部接種葉、上部葉片中的SA含量的影響Fig.1 Effect of TMV injection on SA content in the upper and the lower leaves of HZNH tobacco plant

圖2 SA處理HZNH后同側(cè)上部葉SA含量Fig.2 SA content in ipsilateral upper leaves of HZNH after SA treatment

圖3 TMV接種對Xanthi-nc品種煙草下部接種葉、上部葉片中的SA含量的影響Fig.3 Effect of TMV injection on SA content of the upper and the lower leaves of Xanthi-nc tobacco

圖4 SA處理后Xanthi-nc同側(cè)上部葉SA含量的變化Fig.4 SA content changes in ipsilateral upper leaves of Xanthi-nc after SA treatment

與煙草品種HZNH相似，煙草抗病品種Xanthi-nc在接種TMV后接種葉和同側(cè)的上部葉SA含量呈現(xiàn)上升趨勢，在觀測時間段內(nèi)，最大值均出現(xiàn)在接種后的12h（圖3），但后者的上升斜率大于前者，說明煙草品種Xanthi-nc在TMV誘導(dǎo)后體內(nèi)SA激活表達比HZNH更為敏感。涂抹SA處理后，其同側(cè)上部葉較相應(yīng)的對照葉SA的含量有一定上升，在12小時時更加明顯（圖4）。

圖5 TMV接種對K358品種煙草下部接種葉、上部葉片中的SA含量的影響Fig.5 Effect of TMV injection on SA content in the upper and the lower leaves of K358

對于感病品種K358而言，進行接種TMV處理后接種葉和同側(cè)上部葉SA的含量也表現(xiàn)出明顯的上升趨勢（圖5），接種葉的SA含量上升幅度比抗病品種Xanthi-nc小、與HZNH相當(dāng)，同側(cè)上部葉SA的含量上升幅度遠小于抗病品種Xanthi-nc、稍小于HZNH。雖然感病品種K358在接種TMV后也激發(fā)了信號分子SA的表達，但并沒有表現(xiàn)出抗病特性，這可能與不同遺傳型對SA敏感程度及其它生化途徑的差異有關(guān)系。

同樣，感病品種K358在涂抹SA后其同側(cè)上部葉SA含量也比對照處理代謝高一些，但在不同時間段處理和對照間的差異沒有明顯的變化（圖6）。這與抗病品種HZNH、Xanthi-nc相比存在差異。

圖6 SA處理后煙草品種K358接種葉和上部葉SA含量的變化Fig.6 SA content changes in the upper and the lower leaves of K358 afer SA treatment

圖7 不同處理下不同煙草品種過氧化氫的動態(tài)變化Fig.7 Dynamic changes of H2O2 among different varieties under different treatments

2.2 不同處理下過氧化氫的動態(tài)變化

在對3個煙草品種進行接種TMV、涂抹SA和涂抹PBS處理后進行染色，觀察過氧化氫的動態(tài)變化，其結(jié)果見圖7。圖中出現(xiàn)褐色的是過氧化氫染色部分，顏色越深過氧化氫越多。在3個品種中，感病品種K358接種TMV和涂抹SA處理后均沒有觀察到明顯的過氧化氫（圖7-A，B）。而抗病品種Xanthinc和HZNH在進行相關(guān)的處理2h后均可以觀察到明顯的過氧化氫，并在隨后的幾個時段觀察發(fā)現(xiàn)過氧化氫迅速增加并向四周擴散（圖7-C，D，E，F(xiàn)）。在PBS處理后沒有觀察到明顯的過氧化氫的產(chǎn)生（圖7-G）。說明感病品種不具有被誘導(dǎo)激活的防衛(wèi)反應(yīng)機制，PBS也不是誘導(dǎo)物質(zhì)。

3 討論

3.1 SA和H2O2在系統(tǒng)獲得性抗病性中作用的分析

水楊酸作為植物抗病反應(yīng)的重要信號分子，涉及并參與植物的超敏反應(yīng)（HP）和SAR反應(yīng)，在植物的SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗病反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[11-13]。許多研究表明植物在HP的最初階段，病原菌或激發(fā)子與位于原生質(zhì)膜的受體結(jié)合后，G蛋白可能通過活化蛋白激酶增加與諸如O2.－、H2O2等活性氧密切相關(guān)的原生質(zhì)膜上的NAD（P）H氧化酶、依賴于NADP的過氧化物酶和超氧化物合酶等活性，從而最終導(dǎo)致氧化迸發(fā)(oxidative burst)[13]。而O2.－、H2O2等活性氧不僅可以直接殺傷病原菌，參與膜脂過氧化，介入HP，而H2O2還可以促進細(xì)胞壁木質(zhì)化和HP細(xì)胞死亡。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后SA水平急劇增加，而且SA可以同時通過增加SOD等H2O2產(chǎn)生酶類的活性和抑制CAT/APX等降解酶類的活性，最終積累H2O2來提高植物的抗病性[12]。我們另外一個實驗中，與本實驗相同的兩個具有SAR的抗病品種也獲得了枯斑癥狀[5]，并且有效地阻止了花葉病的發(fā)生。

SA和SA結(jié)合過氧化氫酶相互作用導(dǎo)致過氧化氫酶活性的抑制和SA的產(chǎn)生。從機理上講，這兩個偶聯(lián)事件可能涉及到SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進而導(dǎo)致SAR的建立和HP的發(fā)展。本研究直接觀察了煙草在接種TMV和涂抹SA后信號分子過氧化氫的動態(tài)變化，為相關(guān)的理論解釋提供了最直觀的證據(jù)。同時，我們發(fā)現(xiàn)的一個黃花煙品種HZNH也具備這個特征。在另外一個實驗中，我們克隆出HZNH的相關(guān)抗性基因，發(fā)現(xiàn)這兩個抗性品種雖然不是一個種，但這個與SAR相關(guān)的基因卻具有很高的同源性[11]。

3.2 不同煙草品種對SA含量上升的敏感差異性分析

不同作物在產(chǎn)生SAR時的信號分子存在一些差異，有的作物信號分子是SA，而有的是JA[2,6]。第二信使有的是過氧化氫，而有的是乙烯。說明不同遺傳型作物本身在形成SAR特性時就已經(jīng)存在一些差別。對于具有SAR特性的煙草品種來說，SA含量的中度或稍微升高就會誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生，但品種間存在一些差異。其原因可能主要有以下兩個方面：系統(tǒng)獲得性抗病性的誘導(dǎo)產(chǎn)生過程中涉及到一系列生化代謝反應(yīng)，SA僅僅是激發(fā)子誘導(dǎo)激活這些反應(yīng)，如果被處理植株本身在其它代謝環(huán)節(jié)中有缺陷，即使SA含量提高也無法激活SAR反應(yīng)；不同遺傳型對SA的敏感程度不同或者有的就鈍感，當(dāng)SA含量沒有達到一定的閾值時根本就無法激活相應(yīng)的反應(yīng)。具有SAR特性的抗病品種能夠形成明顯的枯斑，而感病品種則不能[5]，本實驗中感病品種K358 SA含量上升沒有激發(fā)SAR可能就是由于缺乏某種機制。其具體原因還需要進一步設(shè)計實驗加以驗證。

4 結(jié)論

本研究以國際上公認(rèn)的TMV抗性品種Xanthinc和作者發(fā)現(xiàn)的新抗性品種HZNH為材料，以接種TMV和涂抹SA為誘導(dǎo)因素，在不同時間、部位對信號分子過氧化氫信號和系統(tǒng)物質(zhì)SA進行了檢測，證明這兩個抗性材料均屬于系統(tǒng)獲得抗病性、其主要途徑是SA系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子就是過氧化氫，并且新抗性品種HZNH的抗性基因與Xanthi-nc具有很高的同源性、均屬于N基因家族成員[11]（另外文章中）。而感病品種K358不具有此類特征。這些對于進一步研究TMV抗性機理及改良煙草品種抗病性具有重要的參考意義。

[1]王鈞, 金巧玲.植物系統(tǒng)獲得性抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) [J].生命科學(xué), 1998, 10(01): 7-13.

[2]李德紅, 潘瑞熾.水楊酸在植物體內(nèi)的作用 [J].植物生理學(xué)通訊, 1995, 31(02): 144-149.

[3]蔡新忠, 鄭重.水楊酸在植物抗病反應(yīng)中的作用 [J].植物生理學(xué)通訊, 1998, 34(04): 297-304.

[4]余迪求, 岑川, 李寶健, 等.植物系統(tǒng)獲得的抗病性和信號傳導(dǎo) [J].植物學(xué)報, 1999, 41(02): 115-124.

[5]陳學(xué)平, 夏凱, 孔繁明, 等.煙草品種對TMV抗性差異的比較研究 [J].中國煙草科學(xué), 2001, 22(01): 1-3.

[6]Low P, Merida J.The oxidative burst in plant defense:function and signal transduction [J].Physiol Plantarum,1996, 96(3): 533-542.

[7]Chen Z, Silva H, Klessig D F.Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid [J].Science, 1993, 262(5141): 1883-1886.

[8]Hammond-Kosack K, Jones J D.Responses to plant pathogens [J].Biochemistry and molecular biology of plants, 2000, 1102-1156.

[9]Chamnongpol S, Willekens H, Moeder W, et al.Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H2O2in transgenic tobacco [J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(10): 5818-5823.

[10]Dinesh-Kumar S, Tham W-H, Baker B J.Structure–function analysis of the tobacco mosaic virus resistance gene N [J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000,97(26): 14789-14794.

[11]Zhang GY, Chen M, Guo JM, Xu TW, Li LC, Xu ZS, Ma YZ, Chen XP.Isolation and Characteristics of the CN Gene,a Tobacco Mosaic Virus Resistance N Gene Homolog, from Tobacco.Biochem Genet.2009.47(3-4):301-314.

[12]Chen Z, Malamy J, Henning J, et al.Induction,modification, and transduction of the salicylic acid signal in plant defense responses [J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92(10): 4134-4137.

[13]Durner J, Shah J, Klessig D F.Salicylic acid and disease resistance in plants [J].Trends Plant Sci, 1997, 2(7): 266-274.

Study on variation of signal molecule SA and H2O2in TMV inoculated tobacco

GU Houwu1, HE Kuanxin1, LIU Zaiqiang1, XU Qingkai1, GUO Jiaming2, CHEN Xueping2
1 Jiangxi Provincial Tobacco Corporation, Nanchang 330002, China;2 University of Science and Technology of China, Hefei 230052, China

Two disease-resistant and one susceptible tobacco varieties were used to determine variation of signal molecule SA and H2O2in tobacco inoculated with TMV by the method of antibody and location staining.Results showed that inoculation with TMV could induce the rise of SA which reached maximum in 12h.SA content in the inoculated leaves rose higher than that in the same side upper leaves, and such difference was found among different varieties.TMV inoculation could also induce the rise of H2O2and facilitate H2O2spread from inside to outside while neither susceptible variety nor control group treated with PBS could.

TMV; signal transduction; tobacco

顧厚武，何寬信，劉再強,等.TMV侵染后煙草中信號分子水楊酸和過氧化氫的變化[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（5）

江西省煙草公司“提高煙草抗逆性新型調(diào)節(jié)物質(zhì)研制及應(yīng)用”（贛煙2011年98號）和池州市煙草公司“生物綠肥在生產(chǎn)中應(yīng)用研究”（池?zé)?011.11.18）

顧厚武，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：煙葉栽培,Email:359216119@qq.com

陳學(xué)平，博士，教授，研究方向：煙草生物技術(shù)、煙草栽培生理生化,Email:chenxp08@ustc.edu.cn

2014-07-13

:GU Houwu, HE Kuanxin, LIU Zaiqiang, et al.Study on variation of signal molecule SA and H2O2in TMV inoculated tobacco[J].Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(5)