樊斐，張國軍，康熙雄，翟燕紅

·技術與方法·

微流控芯片免疫分析抗體固定方法比較

樊斐，張國軍，康熙雄，翟燕紅

化學分析設備微型化領域或微流控分析系統(tǒng)，也稱為“微全分析系統(tǒng)（μTAS）或芯片實驗室（LOC）”，目前已受到廣泛關注［1-2］。20世紀中期，在微流控芯片上建立的一種新型分析平臺［3］，目前已被廣泛應用在生物研究的各個領域［3］，例如細胞培養(yǎng)［4-5］、單細胞檢測［6］、基因分析［7-8］和免疫分析［9-10］。近年來，微流控技術得到廣泛應用，尤其是在免疫分析方面，比如對于蛋白質的檢測等。但是，在研究中我們發(fā)現(xiàn)抗體在微流芯片基底表面的固定是影響微芯片免疫分析的關鍵因素之一，不僅要求目標蛋白能高效固定，同時要求固定后的目標蛋白能夠較好地保持原有的生物活性，能夠高效地捕捉靶蛋白。整個實驗中，抗體在微芯片載體表面的固定是后續(xù)實驗完成的基礎，決定著實驗結果的好壞。因此，本文通過對兩種不同的抗體固定方法進行比較研究，分析利弊，以為相關研究者提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

甲胎蛋白（AFP）單克隆抗體、AFP標準品和辣根過氧化物酶（HRP）標記的AFP抗體購自北京科躍中楷生物技術有限公司；HRP化學發(fā)光底物液為美國Millipore公司產品；聚二甲基硅氧烷（PDMS）基本組分和固化劑為美國Dow Corning公司產品；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于北京欣經科生物技術有限公司；牛血清蛋白（BSA）購于德國Merck公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱為上海一恒科學儀器有限公司產品；微流控成像儀為國家科學納米中心產品；晶芯SmartArrayer-48點樣儀為生物芯片北京國家工程研究中心產品。

1.2 方法

1.2.1 微流控芯片的制備本研究中所用的微流芯片為7個通道。先通過機械加工法制作微流通道的模具，然后用模塑法翻模制備微流通道，具體步驟如下：先將PDMS基本組分和固化劑以10∶1的比例混合，真空抽氣使浮在表面上的氣泡破裂。將抽氣后的混合物澆鑄在模具上放到80℃烘箱中25 min，冷卻后移去固化的PDMS層，再用帶針的注射器在PDMS層上打孔以得到通道的進樣孔，使用不同尺寸的模具，即可獲得相應尺寸的微流通道。

1.2.2 微流控芯片檢測AFP根據夾心免疫分析的原理，首先在微通道內加入AFP抗體并固定，然后揭去通道并在與所固定的抗體條帶垂直的方向上鋪另一個通道，每個通道通入20 μl 3%BSA封閉非特異性位點，接著向每一通道中加入20 μlAFP標準品與基底表面過量的AFP抗體反應，最后一個通道作為空白對照，常溫下孵育30 min，那么在兩通道交叉的方向上就會形成抗原抗體復合物，通入PBS清洗去除未結合的抗體和抗原。每個通道加入20 μl HRP-AFP抗體，常溫下孵育30 min，即形成夾心免疫復合物。清洗之后，去除微流通道并在PDMS基底上反應區(qū)域加上化學發(fā)光底物，然后放入微流控成像儀檢測。因為復合物中酶的含量與樣本中AFP含量正相關，所以根據化學發(fā)光的強度即可定量測定AFP。

1.2.3 不同尺寸微流通道的比較微流通道的尺寸對微芯片免疫分析的影響是不容忽視的，所以首先需要選擇用于微芯片免疫分析最合適的尺寸。我們采用機械加工方法分別制作出高度和寬度皆為100、300、500、800 μm的微流通道模具，再經翻模得到相應尺寸的微流通道。將各尺寸微流通道與PDMS基底緊密貼合，其余實驗步驟按方法1.2.2進行，AFP濃度依次為400、200、100、50、25、12.5 ng/ml，最后分析實驗結果選出最適合的微流通道尺寸。

1.2.4 基于微流通道固定抗體的試驗將得出的最佳尺寸的微流通道固定在PDMS基底上，從進樣孔分別加入20 μl濃度為40 μg/ml的AFP抗體，室溫孵育30 min后吸出，清洗1次，去除上層微通道，待基底干透后，按方法1.2.2進行抗原檢測，檢測AFP濃度為50 ng/ml，HRP-AFP抗體以1∶200稀釋，其他條件不變。

1.2.5 基于點樣法固定抗體的試驗將AFP抗體用點樣緩沖液稀釋到40 μg/ml，取10 μl加入到384孔板中，用晶芯SmartArrayer-48點樣儀在PDMS基底表面按照預先設定好的模式進行點樣。模式1：用d=120 μm的點樣針進行連續(xù)點樣，同一陣列內各點間距為120 μm，各陣列左右間距為4 mm，上下間距為2 mm；模式2：用d=300 μm的點樣針進行單點點樣，點間距為2 mm。室溫固定30 min后，將基底與微通道黏結后，按方法1.2.2進行抗原檢測，AFP濃度依次為400、200、100、50、25、12.5 ng/ml，分別加入到每一通道內進行反應，HRP-AFP抗體以1∶200稀釋，其他條件不變。

2 結果

2.1 微流通道尺寸篩選

結果表明，寬度為100 μm微流通道檢測結果未見明顯信號（圖1A）。雖然通過延長曝光時間可見到一些發(fā)光點，但亮度極暗，而且曝光時間延長，使發(fā)光液顯現(xiàn)出來，導致背景值極高，對比度不顯著；寬度為300 μm微流通道檢測結果信號區(qū)域窄，均一性相對較差，而且有些檢測點未出現(xiàn)信號（圖1B），同時在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，微流通道尺寸過細不僅增加了加樣難度，而且容易出現(xiàn)漏液的現(xiàn)象；寬度為500 μm微流通道的檢測結果顯示，所有陽性點均可檢測到發(fā)光，信號區(qū)域大小適中并且與背景的對比度明顯，實驗也未出現(xiàn)漏液的現(xiàn)象（圖1C）。如果再增加微通道寬度至800 μm，則不僅樣品和試劑的消耗量增加，而且還需要增加清洗次數(shù)。由此認為，寬度為500 μm的微流通道為最佳選擇。

2.2 點樣法與微流通道法的比較

雖然點樣方法具有批量包被的優(yōu)勢，但是圖2結果說明此方法芯片內變異較大，信號均一性較差，信號強度隨抗原濃度增高而遞增的規(guī)律性不明顯，而且還需要將微流通道對準所固定的抗體，使得操作復雜。圖3說明采用微流通道方法固定抗體變異較小，信號區(qū)域大小適中，結果較穩(wěn)定，更適合用于微流控芯片免疫分析。但是，采用這樣的固定方法一次性包被量少，不適合批量進行，因此還需要進一步改善。

圖1 四種通道尺寸的標準品化學發(fā)光檢測成像圖片比較（A：100 μm；B：300 μm；C：500 μm；D：800 μm）

圖2 基于點樣法固定抗體的結果

圖3 基于微流通道法固定抗體的結果

3 討論

微流控芯片在世界范圍屬于分析技術的前沿，其在疾病診斷領域所具有的優(yōu)勢和應用前景被分析化學科研界以及臨床診斷和科學儀器產業(yè)界所認可，尤其是在免疫分析方面。盡管微流免疫分析系統(tǒng)在實驗室獲得了比較好的結果，但要完全產業(yè)化還需要更多的努力，還需對芯片制造、表面修飾、抗體的固定、集成檢測及免疫化學反應等技術進行組合優(yōu)化。

近年來人們嘗試了各種載體和修飾方法，并對抗體在這些載體上的固定進行了研究，然而迄今為止還沒有一種能同時滿足不同要求的抗體固定技術。本研究分析了微流通道尺寸對結果的影響，并對AFP抗體在微流控芯片固相載體表面的固定方法進行了優(yōu)化。理想的抗體固定應具備以下特點：維持抗體結構完整，使其保持與抗原結合的能力；不同批次芯片之間以及同一芯片上各點應整齊均一；非特異性吸附較小、信噪比高；抗體有較長的保質期。從本研究的結果來看，采用微流通道進行抗體固定時，各信號整齊均一，芯片內變異較小，而且非特異性吸附較小、信噪比高，相比點樣法更適合用于微流控芯片免疫分析。所以在后續(xù)的研究中可以采用微流通道的方法進行抗體固定，但是下一步需要對此方法進行改進，以便于批量包被，這樣更有利于產業(yè)化，有助于更廣泛地應用到蛋白質組學研究、新藥開發(fā)、醫(yī)學基礎研究和臨床診斷等研究領域。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.016

100026北京，首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院檢驗科（樊斐、翟燕紅）；100050北京，首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院實驗診斷中心（張國軍、康熙雄）

翟燕紅，Email：zhaiyanhong2006@126.com

2014-05-20