李富金 王蕾 李金波 秦緒偉

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一株水貂源偽狂犬病毒株的分離鑒定

李富金 王蕾 李金波 秦緒偉

（齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東濟(jì)南 250100）

從遼寧大連疑似水貂偽狂犬病發(fā)病死亡水貂腦、內(nèi)臟中及飼喂的豬肝中分離到1株病毒并進(jìn)行了鑒定。該分離毒株接種BHK-21細(xì)胞24 h后出現(xiàn)圓縮、聚集、脫落等典型的細(xì)胞病變(CPE)；分離毒株能夠被偽狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清中和；分離病毒接種家兔后，引起家兔出現(xiàn)奇癢等典型的偽狂犬病臨床癥狀；同時(shí)根據(jù)GenBank公布的PRV的基因設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增出特異性的目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序比較，表明擴(kuò)增產(chǎn)物序列為豬偽狂犬病毒gE基因序列。以上結(jié)果表明，該病毒為偽狂犬病毒，依據(jù)來(lái)源確定為水貂源性偽狂犬病病毒株。

偽狂犬病是由皰疹病毒科偽狂犬病毒引起豬、馬、牛、羊等家養(yǎng)動(dòng)物，犬、貓等伴侶動(dòng)物，家兔和小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以及水貂、狐貍等毛皮動(dòng)物等多種動(dòng)物的一種傳染病[1]。在獸醫(yī)臨床上豬的偽狂犬病最為常見(jiàn)，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)集約化、規(guī)模化的發(fā)展，20多個(gè)省、市(區(qū))相繼報(bào)道了本病的發(fā)生，并且引起新生仔豬的急性死亡及4周齡以上的仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀[2]。近幾年狐、貉、貂等毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖者為了減低成本，用豬、牛、羊、兔的下腳料作為蛋白日糧，如果日糧污染了偽狂犬病毒，就會(huì)引起毛皮動(dòng)物感染，貂、狐、貉感染后出現(xiàn)奇癢和腦脊髓炎，動(dòng)物出現(xiàn)自咬、呼吸困難等臨床表現(xiàn)。筆者最近接診遼寧大連一例病例，近1000水貂及2000只狐貉死亡，筆者從疑似偽狂犬病的病死水貂腦、內(nèi)臟及飼喂的豬肝內(nèi)分離到同一株病毒，并進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）病料：無(wú)菌采集疑似偽狂犬病死水貂腦、肺、淋巴結(jié)及日糧原料豬肝為分離病毒病料。（2）細(xì)胞：倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)由齊魯動(dòng)物保健品有限公司研究所保存。（3）DMEM：培養(yǎng)基細(xì)胞生長(zhǎng)液：10%血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞維持液：2%血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，購(gòu)自GIBICO。（4）標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清及PRV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司研究所保存。（5）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔、小白鼠，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司質(zhì)檢部提供。（6）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀。

1.2 方法 （1）按照偽狂犬病毒分離方法進(jìn)行[3]。（2）病料處理：無(wú)菌取病水貂腦組織、淋巴結(jié)、肺等組織，用滅菌生理鹽水配成1:5乳懸液，勻漿，反復(fù)凍融3次，以3000r/min離心10min，取上清液加入青霉素和鏈霉素溶液，置4℃冰箱中作用12h備用；作為日糧組分的豬肝用滅菌生理鹽水配成1:5乳懸液，勻漿，反復(fù)凍融2~3次后，以3000r/min離心10min，取上清液加入青霉素和鏈霉素溶液，置4℃冰箱中作用12h備用。（3）家兔接種試驗(yàn)：取2只健康成年家兔，頸部皮下注射2ml，另設(shè)注射無(wú)菌生理鹽水的2只為對(duì)照。（4）小鼠接種試驗(yàn)：取8只小白鼠皮下注射病料濾液0.2ml/只，另設(shè)注射無(wú)菌生理鹽水的2只為對(duì)照。（5）病毒培養(yǎng)與傳代：在長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞上接種0.5ml病毒濾液，在37℃濃度為5%的CO2中培養(yǎng)4~6d。每天觀察細(xì)胞病變(CPE)，當(dāng)出現(xiàn)70%CPE收獲病毒，經(jīng)3次反復(fù)凍融，以5000r/min離心，用上清液接種細(xì)胞。（6）毒價(jià)測(cè)定：取病毒培養(yǎng)物，經(jīng)10倍系列稀釋，按0.1ml接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)孔，每天觀察CPE產(chǎn)生情況，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。（7）中和試驗(yàn)：將PRV陽(yáng)性血清和陰性血清分別進(jìn)行10倍系列稀釋，加等量的200TCID50，37℃作用20min。分別接種96孔板單層 BHK-21細(xì)胞，每孔0.1ml，每個(gè)稀釋度接種8孔，第11列為空白對(duì)照，第12列為標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株對(duì)照(200TCID50)。記錄各個(gè)梯度的細(xì)胞病變數(shù)，連續(xù)觀察5d。同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株與陽(yáng)性血清及標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株與陰性血清對(duì)照。方法同上。（8）引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank已公布的PRVgE基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。上游引物：5'-GCCCACGCACGAGGACT ACTACGA-3'下游引物：5'-TTAAGCGGGGCGGGACAT CAACAG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度298bp。（9）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：將病毒接種BHK-21細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70%以上時(shí)收集細(xì)胞，酚-仿法提取病毒DNA，PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，65℃30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)。72℃延伸8min，最后取PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 家兔接種試驗(yàn) 水貂內(nèi)臟及豬肝病料處理濾液在接種家兔后24~36h體溫升高，因接種部位奇癢而用嘴啃咬，致使接種部位脫毛，皮膚潰爛出血。家兔躁動(dòng)不安，不時(shí)轉(zhuǎn)圈，呼吸急促，至48h四肢麻痹，抽搐而死。對(duì)照組家兔健康無(wú)發(fā)病。

2.2 小白鼠接種試驗(yàn)小鼠接種水貂內(nèi)臟及豬肝病料處理濾液24h內(nèi)都出現(xiàn)了興奮不安，食欲下降，36h后出現(xiàn)被毛雜亂，用嘴咬接種部位，48h后小鼠全部死亡。對(duì)照組小鼠健康無(wú)任何癥狀。

2.3 接種細(xì)胞的病變 水貂病料接種BHK細(xì)胞后，P1代培養(yǎng)96h無(wú)CPE，P2代培養(yǎng)72h出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象，P3代培養(yǎng)24h出現(xiàn)細(xì)胞融合、脫落現(xiàn)象。豬肝病料接種BHK細(xì)胞后，P1、P2代培養(yǎng)96h無(wú)CPE，P3代培養(yǎng)24h出現(xiàn)細(xì)胞融合、脫落現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

圖1 病料引起B(yǎng)HK細(xì)胞CPE(左圖)和正常BHK細(xì)胞(右圖)

2.4 病毒 TCID50測(cè)定 按Reed-Muench法測(cè)得病毒滴度為104TCID50/ml。

2.5 中和試驗(yàn)結(jié)果 PRV陽(yáng)性血清能夠抑制細(xì)胞病變的產(chǎn)生，表明陽(yáng)性血清對(duì)分離株病毒有中和能力，分離的病毒是偽狂犬病毒。

2.6 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果 水貂病料培養(yǎng)物及豬肝病料培養(yǎng)物均擴(kuò)增出了特異性片段，長(zhǎng)度為298bp，與預(yù)期目的片斷相同(見(jiàn)圖2)，二者測(cè)序結(jié)果相似性99.7%，序列Blast與GenBank收錄的PRV gE基因(AY170318)相似性98%。

圖2 病料接種BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物PCR產(chǎn)物電泳圖

左圖：M：Marker DL2000；1：陰性對(duì)照；2：水貂病料細(xì)胞培養(yǎng)物P3代。右圖：M：Marker DL2000；1：豬肝病料細(xì)胞培養(yǎng)物P3代；2：陰性對(duì)照。

4 討論

（1）本次遼寧大連水貂發(fā)病死亡是飼喂了豬肝后急性發(fā)病，本試驗(yàn)從疑似偽狂犬水貂病料中分離到一株偽狂犬病毒，從飼喂的日糧豬肝中也分離到同一病毒，因此判斷，水貂偽狂犬病毒的來(lái)源是豬肝。從而為毛皮動(dòng)物偽狂犬病實(shí)施科學(xué)有效防治措施提供依據(jù)。（2）一些養(yǎng)殖戶為了降低成本，有時(shí)候選用病死豬、牛、羊、家禽作為毛皮獸肉食飼料，而這些飼料安全性比較差，可能含有大量病毒、病菌及毒素等，一旦處理不好就會(huì)引起食物中毒。病從口入，預(yù)防該病還要從食物上著手，對(duì)來(lái)源不明的豬、牛、羊、兔等下腳料一定熟喂，并認(rèn)真檢查是否熟透，還要做到生熟分開(kāi)，浸泡畜禽副產(chǎn)品的水經(jīng)消毒后排放。加強(qiáng)滅鼠工作，防止帶毒老鼠污染食物。（3）近幾年河北昌黎、樂(lè)亭、石家莊，山東臨沂、濰坊等毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖集中區(qū)域都有毛皮獸偽狂犬病發(fā)生，損失慘重。臨床調(diào)查顯示，發(fā)病案例都有飼喂豬、牛下腳料的飼喂史或者挨著豬場(chǎng)比較近，毛皮動(dòng)物偽狂犬防疫刻不容緩。

[1] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所. 動(dòng)物傳染病學(xué)(第1版)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社. 1999. 177-179.

[2] 陳煥春, 方六榮, 何啟蓋等. 豬偽狂犬病A株的分離鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1998. 29(2): 156-161.

[3] 殷震, 劉景華主編. 動(dòng)物病毒學(xué)(第2版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社. 1997. 988-1009.

[4] 王殿永,秦緒偉,許凌涵等.一起狐、貉偽狂犬病的診治[J]. 山東畜牧獸醫(yī). 2013(1).

[5] 趙支國(guó). 食源性偽狂犬病引起多種動(dòng)物死亡的病例分析[J]. 北方牧業(yè). 2013(4): 27.

（2015–04–08）

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