馬 晨，陳雪華，錢 程

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)試驗(yàn)室，海南海口 571101）

?？谑惺惺坌迈r蔬菜微生物污染分析

馬 晨，陳雪華，錢 程

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)試驗(yàn)室，海南海口 571101）

選取生菜、香菜、小蔥、黃瓜、番茄、豆芽（苗）等6類高污染風(fēng)險(xiǎn)蔬菜，考查其細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、可培養(yǎng)的細(xì)菌種類及4類食源性致病菌（沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）等指標(biāo)。結(jié)果表明，供試蔬菜細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)均較高，分別在102～104g-1和240～1 100 g-1，且符合以下規(guī)律，香菜＞生菜＞小蔥＞豆苗＞番茄＞黃瓜；香菜和生菜中可培養(yǎng)的細(xì)菌種類存在部分差異，相似菌屬包括葡萄球菌屬、微小桿菌屬、庫特菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬和檸檬酸桿菌屬等條件致病菌；香菜和生菜中分別分離到1株疑似沙門氏菌和大腸桿菌O157。故生食生菜和香菜可能存在安全風(fēng)險(xiǎn)；農(nóng)田土、有機(jī)肥和灌溉水中可培養(yǎng)的細(xì)菌種類與香菜和生菜相似，且也檢測(cè)到大腸桿菌、李斯特菌和沙門氏菌。故受污染的環(huán)境樣品是蔬菜中食源性致病菌的潛在污染源。

新鮮蔬菜；微生物污染；食源性致病菌；mini-VIDAS；VITEK；海口

新鮮蔬菜可提供必需的維生素等營養(yǎng)，是餐桌上必不可少的食物。為了防止維生素等營養(yǎng)的流失，人們更加偏向于生吃新鮮蔬菜［1］。在我國，生食新鮮蔬菜的產(chǎn)量和消費(fèi)量也日益增多。但由于缺少加熱過程，生食類蔬菜中微生物污染，特別是食源性致病菌污染對(duì)人類健康存在較大威脅［1］。長期以來，動(dòng)物源性食物被認(rèn)為是食源性致病菌的主要來源，但近年國外爆發(fā)多起新鮮蔬菜食源性致病菌中毒事件［2-4］。如2006年，美國沙門氏菌污染的菠菜造成205人感染，3人死亡；2008年美國的番茄-辣椒沙拉檢測(cè)出沙門氏菌感染；2011年德國爆發(fā)出血性大腸桿菌“毒黃瓜”中毒事件，導(dǎo)致14人死亡。因而由新鮮果蔬引起的食源性致病菌感染也在迅速增加［5］。除致病菌外，新鮮果蔬由于富含營養(yǎng)物質(zhì)，更易滋生多種細(xì)菌，且許多細(xì)菌既是腸道的正常菌群，也是條件致病菌。在一定條件下（如抵抗力下降或腸道菌群失調(diào)時(shí)）能引起機(jī)體感染［6］。另有研究表明，被人類病原菌污染的果蔬不能通過常規(guī)清洗方法徹底消除［7］。所以關(guān)注新鮮蔬菜上微生物（細(xì)菌）的污染水平，特別是食源性致病菌的污染水平，對(duì)保障蔬菜質(zhì)量安全具有重要意義。

海南省地處亞熱帶到熱帶過渡區(qū)，水熱充沛，為食源性致病菌的生存和繁殖提供了有利條件［8］。與溫帶不同，熱區(qū)的四季溫度均適合微生物的生長和繁殖，更有利于食源性致病菌滋生。另外，熱區(qū)復(fù)種指數(shù)高、病蟲害發(fā)生頻繁、田間管理不當(dāng)，動(dòng)物糞便和植物交叉污染嚴(yán)重，因而果蔬上食源性致病菌的污染風(fēng)險(xiǎn)可能較高［8］。最后，熱區(qū)是全國冬季瓜菜的主要供應(yīng)源，微生物安全的問題一旦爆發(fā)可能迅速蔓延，波及范圍巨大，將給社會(huì)和國家?guī)順O大損失。因而，保障熱區(qū)果蔬的微生物質(zhì)量安全意義更加重大。

本文以高污染風(fēng)險(xiǎn)的幾類蔬菜為試驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法（國標(biāo)法），并結(jié)合VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀快速篩選法，著重考查果蔬上細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、可培養(yǎng)的細(xì)菌種類，以及沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等食源性致病菌指標(biāo)，旨在總體了解新鮮蔬菜微生物污染水平，并為新鮮蔬菜的食用安全控制和微生物風(fēng)險(xiǎn)分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市隨機(jī)抽取污染風(fēng)險(xiǎn)較高的生菜、香菜、小蔥、黃瓜、番茄、豆芽（苗）等蔬菜各20份，共計(jì)120份。

另從蔬菜地采集農(nóng)田灌溉水、有機(jī)肥和農(nóng)田土壤樣品各5份。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

主要培養(yǎng)基和試劑參照GB/T 4789.28—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑要求》，均購自北京陸橋技術(shù)有限公司。mini-VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀中的沙門氏菌、大腸桿菌O157和李斯特菌試劑條和VITEK II com Pact 30全自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)的革蘭陰性菌鑒定卡（GN卡）均購自生物梅里埃公司。

1.2 檢測(cè)方法

所有蔬菜樣品去掉表面泥土，簡單清洗，檢測(cè)的樣品重量為50 g。細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群檢測(cè)方法參照GB/T 4789.2/3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)》系列標(biāo)準(zhǔn)。沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等4種

食源性致病菌檢測(cè)方法參照GB/T 4789.4/30/10—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)》系列標(biāo)準(zhǔn)，前增菌和選擇性增菌后，分別采用mini-VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀和選擇性平板畫線分離法檢測(cè)樣品中致病菌，純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并通過VITEK II全自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)分析鑒定或者提取純化菌落DNA，16S r DNA擴(kuò)增后測(cè)序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)以初步確定細(xì)菌種屬。蔬菜和環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的細(xì)菌種類的研究采用TSA平板（胰蛋白胨大豆瓊脂）稀釋涂布，并結(jié)合16S rRNA測(cè)序和VITEK II com Pact 30全自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)分析的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔬菜微生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

按照食品檢驗(yàn)程序，分別對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群檢測(cè)（表1）。

表1 新鮮蔬菜樣品的微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

從表1看出，不同種蔬菜細(xì)菌總數(shù)存在差異，數(shù)值范圍在102～104g-1，且香菜＞生菜＞小蔥＞豆苗＞番茄＞黃瓜。這一結(jié)果可能與蔬菜生長環(huán)境和蔬菜表面結(jié)構(gòu)存在一定關(guān)系［9］。香菜、生菜、小蔥和豆苗生長過程直接與土壤接觸，土壤和有機(jī)肥中的微生物易進(jìn)入蔬菜體內(nèi)，特別是蔬菜根部的微生物數(shù)量明顯高于莖部和葉子［10］。番茄和黃瓜種植中不直接接觸土壤，且番茄表皮光滑，不利于微生物感染。

大腸菌群是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，反映食品糞便污染情況。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各類蔬菜大腸菌群的測(cè)定值均較高，規(guī)律與細(xì)菌總數(shù)相似。故參試蔬菜受大腸菌群污染較重，尤其是生菜、香菜和小蔥。采用m ini-VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀快速篩選法和選擇性平板畫線分離法檢測(cè)蔬菜樣品中致病菌的存在試驗(yàn)表明，2種方法有較好的一致性。從香菜中分離到1株疑似沙門氏菌，從生菜中分離到1株大腸桿菌O157疑似菌株，其他樣品中均未檢出致病菌。

2.2 生菜和香菜中可培養(yǎng)細(xì)菌種類

從表1看出，香菜和生菜中細(xì)菌總數(shù)較多。以這2種蔬菜為代表，研究其中可培養(yǎng)細(xì)菌種類。圖1和2分別揭示了生菜和香菜中相關(guān)細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

由圖1可知，生菜中分離到的細(xì)菌，革蘭氏陽性菌有木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum），革蘭氏陰性菌有吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）、楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter beijerinckii和Acinetobacter harbinensis）、變形桿菌屬（Proteus penneri和Proteus vulgaris）、普羅威登斯菌屬（Providencia thailandensis）、腸桿菌屬（Enterobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas punctata和Aeromonas australiensis）和希瓦氏菌屬（Shewanella litorisediminis）。其中，變形桿菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬是常見的腸桿菌科的條件致病菌。氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬也是環(huán)境中常見的條件致病菌，可引起魚類、牛奶、蔬菜等食品污染和腐敗［11-12］。利用mini-VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀-大腸桿菌O157試劑條，檢測(cè)出1份生菜樣品呈陽性，相對(duì)熒光值為0.72。疑似菌落分離純化后，由VITEK II全自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)分析，結(jié)果為大腸桿菌（表2），置信度98%。該菌株的致病性需經(jīng)腸毒素試驗(yàn)進(jìn)一步確定。故生食生菜可能存在安全風(fēng)險(xiǎn)，需經(jīng)較嚴(yán)格的消毒處理。

圖1 生菜中可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖2 香菜中可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

表2 生菜中疑似大腸桿菌VITEK II鑒定結(jié)果

由圖2可知，香菜中可培養(yǎng)的細(xì)菌主要有革蘭氏陽性菌葡萄球菌屬（木糖葡萄球菌Staphylococcus xylosus和松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri）和微小桿菌屬（Exiguobacterium indicum），革蘭氏陰性菌假單胞菌屬（Pseudomonas bauzanensis、Pseudomonas guariconensis和Pseudomonas cremoricolorata）、腸桿菌屬（Enterobacter cancerogenus）、氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、普羅威登斯菌屬（Providencia thailandensis）、抗壞血酸克呂沃爾菌（Kluyvera ascorbata）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）、楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）和吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）。其中，腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬和氣單胞菌屬是常見的條件致病菌；沙門氏菌是嚴(yán)重的食源性致病菌，是食品衛(wèi)生必檢項(xiàng)目之一。故生食香菜存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，需經(jīng)嚴(yán)格消毒處理。將疑似沙門氏菌菌株分離純化后，由VITEK II全自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)分析，結(jié)果為沙門氏菌屬（表3），置信度99%。血清學(xué)等分型試驗(yàn)待進(jìn)一步確認(rèn)。

表3 香菜中疑似沙門氏菌VITEK II鑒定結(jié)果（GN測(cè)試卡）

本試驗(yàn)僅利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究2類蔬菜中可培養(yǎng)的部分細(xì)菌種類，所得結(jié)果僅占蔬菜中細(xì)菌種類的極少部分。Leff等［13］利用16S rRNA基因焦磷酸測(cè)序技術(shù)，分析一般栽培和有機(jī)栽培條件下不同果蔬的表面微生物種類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同果蔬的表面微生物組成存在明顯差異，但有些蔬菜種類（如芽菜、生菜、番茄等）表面微生物種類極相似，主要是腸桿菌科的細(xì)菌。本試驗(yàn)結(jié)果與該文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。生菜和香菜中可培養(yǎng)的細(xì)菌種類部分相似，以腸桿菌科為主，但也存在部分不同細(xì)菌種屬。2種蔬菜中都檢出葡萄球菌屬、微小桿菌屬、庫特菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬和檸檬酸桿菌屬。與香菜相比，生菜中特有的種屬為不動(dòng)桿菌屬、變形桿菌屬和希瓦氏菌屬。與生菜相比，香菜中特有的種屬為假單胞菌屬、克呂沃爾菌屬和沙門氏菌屬。另外從圖中可發(fā)現(xiàn)，純培養(yǎng)物鑒定出的重名細(xì)菌較多，平均次數(shù)為2～4次，這些細(xì)菌可能是2類蔬菜中的優(yōu)勢(shì)菌。加強(qiáng)對(duì)這些優(yōu)勢(shì)菌殺滅特性的研究，可為開發(fā)蔬菜除菌抑菌技術(shù)奠定基礎(chǔ)［14］。

2.3 環(huán)境樣品微生物指標(biāo)和可培養(yǎng)細(xì)菌種類

新鮮果蔬產(chǎn)品的生長環(huán)境，如土地狀況、有機(jī)肥使用及灌溉水源是蔬菜中食源性致病菌污染的關(guān)鍵因素［9，15］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，沙門氏菌（Salmonella）和李斯特菌（Listeria）能在農(nóng)田灌溉的污水污泥或有機(jī)肥污染的土壤中存活數(shù)月，并可以污染生菜和西芹的地上部分，甚至一直存活到蔬菜收獲期［16-17］。因而，監(jiān)測(cè)菜園中土壤、有機(jī)肥和灌溉水中食源性致病菌，對(duì)保障新鮮蔬菜的微生物質(zhì)量安全具有重要意義。本文采集蔬菜地的農(nóng)田灌溉水、有機(jī)肥和農(nóng)田土壤樣品各5份，測(cè)定大腸菌群數(shù)量和4種食源性致病菌。結(jié)果表明，灌溉水、有機(jī)肥和農(nóng)田土中大腸菌群較豐富，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過被檢蔬菜（表1和4）。所以，農(nóng)田土、灌溉水和有機(jī)肥可能是蔬菜中大腸菌群的潛在來源。另外，灌溉水、有機(jī)肥和農(nóng)田土中分別檢測(cè)到沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌（表4）。雖然蔬菜樣品和環(huán)境樣品并非采自同一地點(diǎn)，但是這一結(jié)果也表明，蔬菜中食源性致病菌可能來源于受污染的土壤、水源或者肥料等環(huán)境。因而，采取有效的農(nóng)田管理措施并保證投入品的微生物安全對(duì)于防止蔬菜致病菌污染至關(guān)重要。另外，采用選擇性平板分離法，挑取疑似菌落或其他可培養(yǎng)菌落，分離純化后，由VITEK II全自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)分析，得到可培養(yǎng)的部分細(xì)菌種類（表5）。其中，腸桿菌屬、庫克菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、沙門氏菌屬、大腸桿菌屬在生菜或香菜中都有檢出。所以，菜園土壤、有機(jī)肥和灌溉水中的“微生物大本營”是蔬菜中微生物污染的潛在來源。對(duì)于土/肥/水中檢測(cè)到的其他菌種，如沙雷菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和泛菌屬等在其他果蔬中也有檢出，且其也是潛在致病菌，對(duì)蔬菜微生物質(zhì)量安全存在威脅［13-14］。

表4 環(huán)境樣品微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

表5 樣品中部分可培養(yǎng)細(xì)菌VITEK II鑒定結(jié)果

3 小結(jié)

蔬菜微生物污染情況。供試蔬菜細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)均較高，數(shù)值分別在102～104g-1和240～1 100 g-1。2個(gè)指標(biāo)數(shù)值均符合以下規(guī)律:香菜＞生菜＞小蔥＞豆苗＞番茄＞黃瓜；香菜和生菜中可培養(yǎng)的細(xì)菌種類存在部分差異，相似菌屬包括葡萄球菌屬、微小桿菌屬、庫特菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬和檸檬酸桿菌屬，部分菌屬是條件致病菌；從香菜中分離到1株疑似沙門氏菌，生菜中分離到1株疑似大腸桿菌O157，經(jīng)VITEK系統(tǒng)鑒定，置信度分別為98%和99%。故生食生菜和香菜可能存在安全風(fēng)險(xiǎn)，食用前需經(jīng)嚴(yán)格的消毒處理。

環(huán)境樣品微生物污染情況。分析農(nóng)田土、有機(jī)肥和灌溉水中可培養(yǎng)的細(xì)菌種類發(fā)現(xiàn)，部分細(xì)菌種類與香菜和生菜中分離到的細(xì)菌種類相似，如腸桿菌屬、庫克菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、沙門氏菌屬、大腸桿菌屬等。另從農(nóng)田土、有機(jī)肥和灌溉水中分別檢測(cè)到大腸桿菌、李斯特菌和沙門氏菌。故污染的農(nóng)田土、有機(jī)肥或灌溉水可能是蔬菜中食源性致病菌的重要來源。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

表4 不同殺菌強(qiáng)度對(duì)產(chǎn)品的影響

2.5 藍(lán)莓草莓混合果醬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.5.1 感官指標(biāo)

醬體呈鮮紅色，表面有光澤，無析水現(xiàn)象。

2.5.2 理化指標(biāo)

總糖（以轉(zhuǎn)化糖計(jì)）:50%～60%；總酸（以檸檬酸計(jì)）:0.5%～1.2%；鉛（Pb計(jì)）:≤1 mg· kg-1；總砷（以As計(jì)）:≤0.5 mg·kg-1；錫（以Sn計(jì)）:≤250 mg·kg-1。

2.5.3 微生物指標(biāo)

符合商業(yè)無菌要求。

2.5.4 保質(zhì)期

保質(zhì)期為18個(gè)月。

3 小結(jié)

通過試驗(yàn)，綜合確定藍(lán)莓草莓混合果醬的加工工藝如下:藍(lán)莓、草莓鮮果打漿后按照1∶1的比例混合，添加0.1%異抗壞血酸鈉和0.05%檸檬酸，以保持混合果漿較好的口感，并保護(hù)其色澤；黃原膠和海藻酸鈉復(fù)合使用（1.25%∶1.25%，m/m）以發(fā)揮最佳的增稠效果；正交試驗(yàn)優(yōu)化后的配方是復(fù)合果漿用量60%、果葡糖漿用量45%、復(fù)合增稠劑用量2.5%，醬體加熱至80℃灌裝封蓋后，在80℃下殺菌25 min即可達(dá)到商業(yè)無菌要求，且產(chǎn)品質(zhì)量符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。

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（責(zé)任編輯：高 峻）

TS 255.7

A

0528-9017（2015）03-0396-06

10.16178/j.issn.0528-9017.20150336

2014-10-28

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（1630052014010）

馬 晨（1986-），女，江蘇徐州人，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称泛铜h(huán)境微生物。E-mail:mc19860112@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式:馬晨，陳雪華，錢程.?？谑惺惺坌迈r蔬菜微生物污染分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（3）:396-401.