韓省華，夏湛恩，吳文娟，沈 雯

（杭州華丹農(nóng)產(chǎn)品有限公司院士工作站，浙江杭州 310024）

阿姆斯特丹散囊菌鑒別與發(fā)酵

韓省華，夏湛恩，吳文娟，沈 雯

（杭州華丹農(nóng)產(chǎn)品有限公司院士工作站，浙江杭州 310024）

阿姆斯特丹散囊菌是從杭州市陳置多年的黑茶“伏磚”中分離純化得到的，經(jīng)中科院微生物所鑒定，屬阿姆斯特丹菌種，但經(jīng)多年自然誘變及分離純化，其形態(tài)特征有別于國內(nèi)現(xiàn)有菌種。通過發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，在不同于黑茶的培養(yǎng)基上同樣產(chǎn)生黑色素，且其代謝產(chǎn)物對立枯病菌和紋枯病菌等有不同程度抑制作用。該菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有新特點(diǎn)，該菌應(yīng)屬于阿姆斯特丹散囊菌亞種。

阿姆斯特丹散囊菌亞種；引物；液體發(fā)酵；拮抗；黑色素

黑茶一詞始見于清代嘉慶三年（1542年），距今已有400多年歷史，到清代形成專銷西北的“官茶”，發(fā)展至今有“伏茶”“伏磚”“金花”等稱謂，不僅名稱各異，分離的菌種也不同，但總體均屬冠突散囊菌類（Eurotium cristatum），屬青綠曲霉。經(jīng)中科院微生物所鑒定，屬該曲霉的阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami L.Mangin）類，經(jīng)加入引物發(fā)酵，從菌絲體中能產(chǎn)生降低血脂的活性物質(zhì)，對一些有害真菌有抗性。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

供試菌種從多種茶葉制品中分離篩選得到冠突散囊菌菌種，經(jīng)進(jìn)一步分離純化得到生長速度快、形態(tài)健壯的菌種，即為F1代的菌種。試劑有真菌基因組DNA提取相關(guān)的試劑盒；Ex Taq酶和PCR測序相關(guān)的試劑；菌種發(fā)酵相關(guān)的試劑，發(fā)酵原料如茶汁、淀粉、魚、畜粉等農(nóng)副原料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離篩選

茶葉微生物分離按國際食品微生物學(xué)檢驗(yàn)方法（GB 4789—2010）進(jìn)行操作分離。

1.2.2 微生物鑒定

由中國科學(xué)院微生物研究所，按照真菌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類鑒定［1-3］。顯微性狀結(jié)構(gòu)按插片法、涂片及粘片法進(jìn)行。

1.2.3 引物發(fā)酵方法

由于在黑茶、伏磚中的阿姆斯特丹散囊菌根據(jù)形態(tài)特性不同，應(yīng)是杭州亞種，生長速度比較慢，通常需經(jīng)1～2個(gè)月生長周期，有的甚至更長。研究發(fā)現(xiàn)，利用某些有機(jī)引物可破解及加快發(fā)酵進(jìn)程，如利用玉米汁、土豆汁及黑茶汁可加快菌種發(fā)酵。同時(shí)通過發(fā)酵配方、發(fā)酵溫度、發(fā)酵酸堿度對菌絲體生長的研究，篩選發(fā)酵最佳狀況，縮短發(fā)酵周期。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試菌種的鑒定

2.1.1 分子分類依據(jù)

真菌核糖體基因及間隔區(qū)有不同進(jìn)化程度，有的序列較保守，有的序列變異較快，可根據(jù)序列進(jìn)行真菌鑒定。位于18S rDNA的3＇端與28S rDNA的5＇端之間的序列稱為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed sPacers，ITS）。本研究使用的引物為真菌ITS上的一段保守序列，引物序列如下:

ITS4:5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；

ITS5:5＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇。

2.1.2 DNA提取

研磨組織塊→移入盛有CTAB的小管→55～65℃孵育→加氯仿異戊醇抽提后離心→上清液加NaAc和異丙醇沉淀DNA、離心→棄上清、乙醇洗沉淀2次→干燥后TE溶解。

2.1.3 PCR擴(kuò)增和測序

94℃預(yù)變性4 min，（94℃1 min→56℃40 s→72℃40 s）30個(gè)循環(huán)。序列流水號196-ITS4 -A47966-G09-1309020291G和196-ITS5-A47966-E09-1309020291G。

2.1.4 DNA序列比較分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建

用校正后的供試樣品的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)區(qū)域序列，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比較搜索（BLASTn）。根據(jù)同源序列搜索的結(jié)果，下載與之相關(guān)的真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)區(qū)域序列，與供試樣品的序列一起用Mega軟件進(jìn)行匹配分析，然后用Phylogenetic Tree顯示系統(tǒng)樹，同時(shí)顯示序列間的相似度。

所顯示的系統(tǒng)樹見圖1。

圖1 基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)區(qū)域序列分析所繪制的系統(tǒng)樹

根據(jù)分子分類依據(jù)，青綠曲霉屬于冠突散囊菌中的阿姆斯特丹散囊菌，但該菌種某些特性已發(fā)生變異。

如在形態(tài)上，菌絲體及發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲體的孢子柄較長，且子囊果呈橢圓形（圖2中1）。菌種液體發(fā)酵時(shí)，不僅在茶葉中產(chǎn)生黑色素，在其他培養(yǎng)基中亦產(chǎn)生黑色素（圖2中2）。其代謝產(chǎn)物對有害真菌如對紋枯病菌、立枯病菌等能產(chǎn)生一定的拮抗作用（圖2中3），至今尚未見研究報(bào)道。據(jù)此可知該菌種應(yīng)為阿姆斯特丹菌種的亞種。

圖2 阿姆斯特散囊菌不同發(fā)酵時(shí)間的搖瓶形態(tài)

2.2 阿姆斯特丹散囊菌的發(fā)酵

采用阿姆斯特丹散囊菌液體發(fā)酵［4-5］，因液體發(fā)酵較固體生長發(fā)酵周期要縮短數(shù)倍，加入原料的安全性可控，發(fā)酵環(huán)境和條件如溫度、PH值、通氣量可人工控制，所形成的產(chǎn)品質(zhì)量好，且生產(chǎn)成本更低，利于產(chǎn)業(yè)化。

2.2.1 阿姆斯特丹散囊菌杭州亞種的發(fā)酵

阿姆斯特丹散囊菌杭州亞種發(fā)酵采用加入引物發(fā)酵的方法，發(fā)酵周期為78～96 h。冠突散囊菌的整個(gè)發(fā)酵過程如圖3所示。

圖3 阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵過程

圖3 顯示，從起始至8～10 h，孢子開始萌發(fā)，至30～45 h菌絲生長形成小網(wǎng)狀，30 h后開始產(chǎn)生孢子，伴隨菌絲體的伸長，新孢子萌發(fā)形成新菌絲，菌絲體似犬牙交叉，菌絲體量開始大量增加，72 h后菌絲體達(dá)最大值，其量接近冬蟲夏草菌種的量。發(fā)酵至72 h前后，有些菌絲形成空泡，其中內(nèi)容物開始析出，發(fā)酵產(chǎn)物開始發(fā)黑，其碳氮利用率下降接近發(fā)酵終點(diǎn)。

2.2.2 不同配方對發(fā)酵的影響

根據(jù)冠突散囊菌的生長特點(diǎn)以及碳氮利用的特點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)不同C:N的發(fā)酵配方，同時(shí)利用玉米汁、土豆汁及黑茶汁等多種有機(jī)浸出物為引物，利用價(jià)廉的農(nóng)資原料，如玉米粉、黃豆餅粉、山芋淀粉、玉米淀粉及蛋白胨、魚粉、麩皮，并加少量KH2PO4等礦物原料，設(shè)計(jì)多種發(fā)酵配方。不同配方對菌絲體鮮重的影響見圖4。

圖4 顯示，4和5號發(fā)酵配方較適合阿姆斯特丹杭州亞種發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵至50～72 h時(shí)，菌絲體進(jìn)入對數(shù)生長期，菌絲體量逐步達(dá)最大值，然后菌絲體出現(xiàn)空泡及自溶，菌絲體量開始逐步下降。

2.2.3 酸堿度對發(fā)酵的影響

研究發(fā)現(xiàn)，酸堿度對阿姆斯特丹杭州亞種的發(fā)酵影響較大（圖5）。

圖5顯示，在PH＜3.5時(shí)，菌絲生長受到抑制，發(fā)酵速度變慢，甚至不能發(fā)酵；而當(dāng)PH＞9.5時(shí)，菌絲體的生長同樣受到影響，發(fā)酵速度變慢，甚至不能正常發(fā)酵。試驗(yàn)證明，當(dāng)PH在6.5左右是發(fā)酵最適酸堿度，菌絲生長很舒展，發(fā)酵速度加快，發(fā)酵菌對原料的利用正常，所形成的產(chǎn)品質(zhì)量好。

圖5 不同PH值對菌絲體鮮重的影響

2.2.4 溫度對發(fā)酵的影響

溫度對阿姆斯特丹杭州亞種的發(fā)酵亦有影響。圖6顯示，在溫度低于24.5℃時(shí)，發(fā)酵速度明顯變慢，發(fā)酵周期延長，但菌絲可繼續(xù)生長；在25.5℃～26.5℃時(shí)，菌絲生長速度較快，發(fā)酵情況正常，糖代謝情況正常；當(dāng)溫度升至29.5℃以上，菌種發(fā)酵減慢，菌絲生長出現(xiàn)異常，若溫度持續(xù)增高，甚至出現(xiàn)菌絲體自溶現(xiàn)象。

圖6 不同溫度對菌絲體鮮重的影響

3 小結(jié)

試驗(yàn)通過菌種的分離鑒定和發(fā)酵，建立一套新的發(fā)酵技術(shù)，并通過研究優(yōu)化發(fā)酵條件，為進(jìn)一步研究創(chuàng)造條件。試驗(yàn)還將進(jìn)一步探索發(fā)酵過程中糖代謝和酸堿度變化規(guī)律，以及菌種菌絲體的形態(tài)變化規(guī)律等，能夠更進(jìn)一步提高菌絲體產(chǎn)量及品質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

TS 272

A

0528-9017（2015）03-0380-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20150331

2014-10-20

韓省華（1956-），陜西城固人，高級農(nóng)藝師，從事真菌應(yīng)用研究工作。E-mail:403564228@qq.com。

文獻(xiàn)著錄格式:韓省華，夏湛恩，吳文娟，等.阿姆斯特丹散囊菌鑒別與發(fā)酵［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（3）:380-383.