韓守兵，張 斯，竺錫武

（1.浙江理工大學生物工程研究所，浙江杭州 310018；2.湖南人文科技學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)研究所，湖南婁底 417000）

棉花黃萎菌病毒VdCV1 OTU蛋白的表達及純化

韓守兵1，張 斯1，竺錫武2*

（1.浙江理工大學生物工程研究所，浙江杭州 310018；2.湖南人文科技學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)研究所，湖南婁底 417000）

采用Gateway技術(shù)將棉花黃萎菌病毒VdCV1的OTU蛋白基因克隆至原核表達載體PET42-DEST中，并在大腸桿菌Escherichia coli BL21中誘導表達，然后通過鎳柱親和層析和分子篩純化得到純化的目的蛋白，并進行Western Blot檢測。結(jié)果表明，BL21表達的OTU蛋白以包涵體形式存在，大小為97 ku。W estern Blot檢測表明，His標簽抗體能與97 ku左右的OUT-His融合蛋白特異性結(jié)合。

OTU蛋白；棉花黃萎?。患兓?/p>

棉花黃萎病是棉花作物的主要病害之一，廣泛分布于世界各產(chǎn)棉國，是由棉花黃萎菌（Verticillium dahliae Kleb）的侵染而引起的棉花黃萎現(xiàn)象，容易導致整棵植株枯死萎蔫。自20世紀90年代以來，我國棉花黃萎病發(fā)生區(qū)域面積逐年增加，難以防治，對棉花生產(chǎn)產(chǎn)生了重大影響。目前，僅發(fā)現(xiàn)一種棉花黃萎菌病毒Verticillium dahliae chrysovirus 1（VdCV1）［1］，是以棉花黃萎菌為宿主的dsRNA病毒，全基因組包括4條dsRNA，其中一條dsRNA編碼Ovarian Tumor Protease（OTU蛋白酶），功能不詳。有關(guān)OTU蛋白酶基因的研究始于對果蠅等動物卵細胞發(fā)育方面的研究［2］，此后經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，真核生物、細菌、病毒來源的含有OTU結(jié)構(gòu)域的蛋白形成了一個大的超級科，有4個保守區(qū)［3］，有裂解泛素-蛋白結(jié)合物和去泛素化的功能［4-5］。研究dsRNA病毒的OTU蛋白是否具有去泛素化、降低真菌免疫力、增強病毒侵染能力的功能，對利用OTU基因及真菌病毒防治棉花黃萎病菌及其他病菌具有重要意義。

本研究表達、純化了病毒VdCV1的OTU蛋白，為研究OTU蛋白功能提供了前提。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Escherichia coli（E.coli）DH5α菌株、E.coli BL21菌株由本實驗室保存，BP反應(yīng)載體PDoner221、LR反應(yīng)載體PET42-DEST（含有H is標簽序列）購自Invitrogen公司，新西蘭大白兔購自杭州師范大學動物實驗中心，rTaq、M lu I酶、Pst I酶、DNA Marker、蛋白Marker購自Fementas公司，IPTG、PMSF、Imidazole、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司，羊抗鼠IgG抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Ni-NTA SweHarose、Ni柱親和層析柱購自杭州艾路生物科技有限公司，引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建

以棉花黃萎菌病毒第4鏈VcR4的cDNA為模板，以P1∶5＇-GGGGAC AAGTTTGTACAAAAAAGCA GGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCGGCCTACAA GAGAGTGATG-3＇和P2∶5＇-GGGGACCACTTTGTAC AAGAAAGCTGGGTATGCCGGTCCTATCATCTGTTC-3＇為引物，用LA Taq聚合酶，PCR擴增OTU基因的ORF框。利用GateWay技術(shù)［6］，經(jīng)過BP反應(yīng)，將目的基因連入PDONR221（Kan+）載體；經(jīng)過LR反應(yīng)，將目的基因連至原核表達載體PET42-DEST（Amp+，含噬菌體T7啟動子）上，酶切鑒定正確后送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.2.2 OTU蛋白的誘導表達及可溶性分析

將測序正確的重組表達質(zhì)粒PET42-VcR4電轉(zhuǎn)至E.coli BL21之中，篩選陽性克隆，按1∶100（V/V）接種于200 m L LB液體培養(yǎng)基（Amp+）中，37℃，225 r·min-1振蕩培養(yǎng)至D600為0.6，加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，37℃誘導表達4 h，4℃，6 000 r·min-1，10 min離心收集菌體。然后加入200 m L PBS振蕩重懸菌體，加入1 mol·L-1PMSF至終濃度為1 mmol·L-1，超聲破碎菌液，12 000 g，10 min，分別取上清液和沉淀，沉淀再用200 m L PBS振蕩重懸；渦旋上清液和沉淀，取出100μL加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻，100℃金屬浴變性10 min；然后4℃超聲破碎菌液，12 000 g，10 min，吸取上清液15 μL，SDS-PAGE電泳檢測［7］。

1.2.3 包涵體的洗滌與溶解

取1 g包涵體，重懸于20 m L包涵體洗滌液Ⅰ（5 mmol·L-1EDTA，20 mmol·L-1Tris，1% Trion-X，PH 8.0），室溫振蕩10 m in，然后4℃，12 000 r·m in-1離心10 min，收集沉淀；加入10 m L包涵體洗滌液Ⅰ重懸，超聲破碎，收集沉淀；加入20 m L包涵體洗滌液Ⅰ重懸。

收集沉淀，加入10 m L包涵體洗滌液Π（5 mmol·L-1EDTA，20 mmol·L-1Tris，4 mol·L-1尿素，0.3 mol·L-1NaCl，PH 8.0）室溫振蕩10 m in，然后4℃，12 000 r·min-1離心10 m in，收集沉淀；重復洗滌3次。

所得沉淀溶于10 m L溶解液（20 mmol·L-1Tris，8 mol·L-1尿素，0.3 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1β-巰基乙醇，PH 8.0），室溫攪拌30 m in，至包涵體溶解，4℃，12 000 r·min-1離心10 min，收集變性蛋白上清液。

1.2.4 Ni柱親和純化重組蛋白

在玻璃層析柱中添加介質(zhì)，確保填料均一無氣泡無分層等現(xiàn)象，然后用5倍體積Lysis buffer平衡介質(zhì)，取1倍柱床體積變性蛋白上清液低速上柱，孵育30 min。加入合適濃度的咪唑洗滌液洗滌，除去未結(jié)合及結(jié)合不牢固的雜蛋白，然后進行梯度濃度洗脫，分別收集洗脫液；SDS-PAGE電泳，確定最佳洗脫濃度；超濾濃縮，透析去離子，然后冷凍真空抽干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 分子篩進一步純化重組蛋白

將Ni柱親和純化的蛋白溶解于8 mol·L-1脲（20 mmol·L-1Tris，8 mol·L-1尿素，PH 8.0）中，利用AKTA Process系統(tǒng)勻速泵進分子篩平衡液（20 mmol·L-1Tris，8 mol·L-1尿素，PH 8.0）平衡，樣品上樣，勻速泵進分子篩洗脫液（0.3 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1Tris，8 mol· L-1尿素）洗脫，通過AKTA Process系統(tǒng)分析，分步收集不同峰段洗脫液；SDS-PAGE電泳，確定分離效果；超濾濃縮，透析去離子，冷凍真空抽干稱重。采用Brad ford法定量檢測純化蛋白［8］。

1.2.6 Western blot鑒定

將經(jīng)分子篩純化的OTU蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；室溫封閉液（0.5 g脫脂奶粉溶于8 m L TBST洗滌液中，混勻定容至10 m L）封閉2 h后，按1∶1 000向封閉液加入His標簽抗體，孵育2 h，TBST洗滌液（TBS洗滌液中加入Tween-20至終濃度為0.05%）洗膜3次，每次10 m in；然后按1∶5 000向封閉液中加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，孵育2 h，TBST洗滌液充分洗膜；顯色液顯色，鑒定雜交結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體pET42-V cR4構(gòu)建結(jié)果

利用LR反應(yīng)將目的基因連入PET-DEST42載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，搖菌提取質(zhì)粒，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在8 281 bP位置出現(xiàn)一條特異性條帶，與理論結(jié)果相符，說明成功構(gòu)建原核表達載體PET42-VcR4。

PCR鑒定結(jié)果如圖1所示，與預(yù)期大小一致（2 550 bP）；質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ單酶切鑒定結(jié)果如圖1所示，切出2個片段，與預(yù)期大小一致（4 936 bP和3 345 bP），其中1號泳道有3個條帶，最大的片段為未酶切完全的質(zhì)粒。

2.2 表達蛋白可溶性分析

重組菌BL21-PET42-VcR4、BL21-PET42-CmR（氯霉素蛋白）經(jīng)4 h誘導表達，超聲破碎后分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳來鑒定蛋白的可溶性。結(jié)果表明，氯霉素蛋白與OTU蛋白均以包涵體形式存在，屬于不可溶性蛋白（圖2）。

2.3 W estern b lot鑒定

為了進一步檢測目的蛋白在大腸桿菌中是否表達，用H is標簽抗體作為一抗，羊抗鼠HRP標簽作為二抗進行Western blot檢測。SDS-PAGE、Western blot結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，BL21-PET42-VcR4超聲裂解后的沉淀出現(xiàn)特異性條帶，其他均未出現(xiàn)條帶，說明OTU蛋白在E.coli BL21中能正確誘導表達，并且以包涵體形式存在。

圖1 入門載體PDOVCR4質(zhì)粒酶切和PCR鑒定電泳圖

圖2 OTU蛋白與氯霉素蛋白的可溶性分析

2.4 N i-NTA柱親和層析純化結(jié)果

對含His標簽的融合蛋白進行純化，SDSPAGE電泳檢測結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，純化得到了條帶較為單一、大小在97 ku左右的蛋白，說明目的蛋白純化效果良好，而且目的蛋白最佳洗脫咪唑濃度為100 mmol·L-1。

2.5 分子篩純化

將純化蛋白進一步過分子篩純化，通過AKETA分析儀，收集不同波段的紫外檢測峰波蛋白溶液，分別進行SDS-PAGE電泳檢測。分析波峰和電泳檢測結(jié)果分別見圖5和圖6。

圖3 OTU蛋白SDS電泳（A）和Western blot檢測（B）

圖4 OTU蛋白的純化結(jié)果

由圖5和6可知，0～8 min收集的樣品，可能混有微量氣泡，電泳沒有條帶；8～17 m in收集的樣品，電泳顯示有一條帶，大小與目的蛋白一致，紫外檢測波峰較好，但條帶不清晰，表明目的蛋白的純化效果較好，但濃度較低。

圖5 分子篩純化的OTU蛋白AKETA波段分析

3 小結(jié)與討論

圖6 分子篩純化的OTU蛋白的SDS-PAGE分析

本研究采用Gateway克隆技術(shù)，成功構(gòu)建棉花黃萎菌病毒VdCV1的OTU蛋白原核表達載體PET42-VcR4；使其在大腸桿菌中穩(wěn)定表達。采用親和層析與分子篩層析相結(jié)合的方法［9-10］，成功純化OTU包涵體蛋白。病毒VdCV1的OTU蛋白的表達、純化，是研究OTU蛋白的前期基礎(chǔ)工作，對研究OTU蛋白酶的功能具有重要意義。

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（責任編輯：侯春曉）

表1 浙粳88秧苗多效唑調(diào)控后不同秧齡栽插經(jīng)濟性狀及產(chǎn)量表現(xiàn)

3 小結(jié)

試驗結(jié)果表明，浙粳88在秧苗1葉1心時噴施多效唑，能有效促進秧苗矮壯，延長栽插秧齡，栽插后對有效穗、結(jié)實率等產(chǎn)生積極影響，最終增加產(chǎn)量，其最佳栽插秧齡是24 d。

在實際生產(chǎn)中，為確保浙粳88的安全齊穗，可在計劃的機插時間前24～27 d育秧，在秧苗1葉1心時，用150 mg·L-1多效唑細噴霧，能延長機插秧齡、增加秧齡彈性，又能增加產(chǎn)量。

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（責任編輯：張才德）

S 435.621

A

0528-9017（2015）03-0365-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20150325

2014-10-16

國家自然科學基金項目（31071729）

韓守兵（1984-），男，安徽六安人，碩士研究生，主要從事植物病毒與天然藥物生物反應(yīng)器研究。E-mail:hanbingxiong @163.com。

竺錫武，研究員，碩士生導師。E-mail:zhuxw9999@yahoo.com.cn。

文獻著錄格式:韓守兵，張斯，竺錫武.棉花黃萎菌病毒VdCV1 OTU蛋白的表達及純化［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2015，56（3）:365-368.