李海濱孫煦勇秦 科鄧添薪趙國志黃程新覃音紅楊 柳

（1.中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州軍區(qū)器官移植中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

熒光素酶標(biāo)記人肝癌細(xì)胞的動(dòng)物模型的建立

李海濱1孫煦勇1秦 科1鄧添薪2趙國志3黃程新1覃音紅1楊 柳1

（1.中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州軍區(qū)器官移植中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

目的：利用熒光素酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞株HEPG2建立裸鼠肝原位移植動(dòng)物模型。方法：裸鼠肝門靜脈接種1×106個(gè)細(xì)胞使其成瘤，經(jīng)活體熒光成像觀察腫瘤的生長情況。結(jié)果：利用熒光索酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HEPG2，成功建立了原位肝癌裸鼠模型。結(jié)論：利用熒光索酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HEPG2，可建立了原位肝癌裸鼠模型。小動(dòng)物活體成像可為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術(shù)，為進(jìn)一步研究肝癌生長轉(zhuǎn)移機(jī)制和藥物開發(fā)提供了新的有用工具。

熒光素酶；肝癌；動(dòng)物模型

生物發(fā)光成像是目前常用的活體成像技術(shù)之一，與其他影像學(xué)技術(shù)相比，熒光素酶發(fā)光的特點(diǎn)是在哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中的背景非常低小，細(xì)胞自身的內(nèi)源性光較低，穿透力強(qiáng)，具有更高的靈敏度，生物發(fā)光技術(shù)成像因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高，活體可在不同時(shí)間點(diǎn)觀察，從而減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物研究等領(lǐng)域[1,2]。本移植中心每年完成 30～50例肝移植患者中多數(shù)為肝癌患者，為更好地監(jiān)測轉(zhuǎn)染了抗癌基因的細(xì)胞植入體內(nèi)的動(dòng)向及效果，給予患者有效的治療，本研究利用表達(dá)了熒光素酶的肝癌細(xì)胞株HEPG2建立了裸鼠肝原位移植動(dòng)物模型。利用生物發(fā)光成像技術(shù)對此模型內(nèi)的腫瘤生長進(jìn)行非侵入性的連續(xù)監(jiān)測，同時(shí)評價(jià)生物發(fā)光成像在裸鼠肝原位移植模型建立中的作用，為肝癌生長轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究和藥物開發(fā)以及細(xì)胞治療提供有效手段。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞HEPG2由加拿大UBC大學(xué)戴龍君教授惠贈(zèng)，L-谷氨酰胺(GIBICO公司)，雙抗(GIBICO公司)，DMEM (GIBICO公司)，胎牛血清（Hyclone公司），熒光素酶底物（Luciferin，Caliper Life Sciences），活體動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)（Lumazone，美國），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C裸鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK桂2014-0003），鼠齡6周，體重18～21g，飼養(yǎng)在SPF飼養(yǎng)間。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用與實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)與解放軍第三〇三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)的許可。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

采用DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，配成含10% 胎牛血清、100IU/ml 雙抗的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置兩孔標(biāo)記了熒光素酶的細(xì)胞與兩孔未標(biāo)記的細(xì)胞于96孔板，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察

收集處于生長對數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，稀釋至2×106cells/ml，取250μl細(xì)胞懸液進(jìn)行肝門靜脈接種，共接種3只。每隔一周觀察一次，連續(xù)觀察四周，觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物(1μl/g)，戊巴比妥鈉(0．1 ml/g)麻醉后平放于活體熒光影像系統(tǒng)攝像，同時(shí)將在96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞分別加入熒光素底物后拍照，并用儀器自身所帶圖像分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)條件下生長良好，細(xì)胞呈梭形或多邊形，飽滿，貼壁生長（如圖1）。

圖1　HEPG2細(xì)胞

2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察

手術(shù)注射人肝癌細(xì)胞HEPG2后一周，2只小鼠死亡，成活1只。將余下1只小鼠麻醉后平放于活體熒光影像系統(tǒng)攝像，發(fā)現(xiàn)裸鼠肝臟出現(xiàn)米粒大小的腫瘤病灶，后面幾次略有增大。培養(yǎng)的細(xì)胞中加入熒光素底物后拍照可見細(xì)胞出現(xiàn)熒光（如圖2）。

圖2　肝癌原位移植模型與細(xì)胞的熒光觀察

3 討論

報(bào)告基因(reporter gene)是一組編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，其與目的基因融合后的表達(dá)產(chǎn)物可用來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控[3-5]。生物發(fā)光成像是目前常用的活體成像技術(shù)之一，與其他影像學(xué)技術(shù)相比，熒光素酶發(fā)光的特點(diǎn)是在哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中的背景非常低小，細(xì)胞自身的內(nèi)源性光較低，穿透力強(qiáng)，具有更高的靈敏度，生物發(fā)光技術(shù)成像因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高，活體可在不同時(shí)間點(diǎn)觀察，從而減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物研究等領(lǐng)域。活體成像技術(shù)是目前廣泛用于腫瘤轉(zhuǎn)移、基因治療、干細(xì)胞示蹤、白血病等相關(guān)領(lǐng)域的研究，因此利用Luciferase標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行小動(dòng)物活體成像能夠更有效地觀察腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程及評價(jià)治療效果[6,7]。

小動(dòng)物成像技術(shù)對能檢測的腫瘤動(dòng)物模型微小病灶的檢測靈敏度極高，能夠無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的動(dòng)物活體觀察，從而對同一對象進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間差異，與傳統(tǒng)的方法相比，可大大減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，同時(shí)符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則，已成為廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域[8]。

本實(shí)驗(yàn)利用熒光素酶基因標(biāo)記人肝癌細(xì)胞HEPG2，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克隆，經(jīng)過多次傳代表達(dá)水平穩(wěn)定，標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)、生長方式、生長速度及致瘤能力等與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯差異，可以反映HEPG2腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的標(biāo)記細(xì)胞。將其經(jīng)肝門靜脈接種裸鼠，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)能夠成瘤，并且腫瘤的體積與發(fā)光強(qiáng)度有相關(guān)性。手術(shù)時(shí)需注意不要將細(xì)胞漏到注射部位外，否則容易對成瘤的成像觀察造成影響。動(dòng)態(tài)觀察4～6周后，可將成瘤動(dòng)物安樂死，獲取病變組織，按病理程序嚴(yán)格操作留樣，相關(guān)研究結(jié)果將后續(xù)報(bào)道。

綜上所述，利用熒光素酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HEPG2成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小動(dòng)物活體成像為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術(shù)，可為進(jìn)一步研究肝癌生長轉(zhuǎn)移機(jī)制和藥物開發(fā)以及細(xì)胞治療提供有效技術(shù)手段。

致謝

本研究得到了加拿大UBC大學(xué)的戴龍君教授的大力幫助，并無私贈(zèng)送了HEP2細(xì)胞，在此表示感謝。

[1] 王一帆,夏睿,郭玉林,等.腺病毒介導(dǎo)熒光素酶報(bào)告基因感染間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志, 2013,33(6):473-477.

[2] 董苑,李彩霞,趙嫻,等.熒光素酶基因穩(wěn)定表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞系的構(gòu)建[J].中華顯微外科雜志,2014,(6): 569-572.

[3] 薛秀花,黃晨西.熒光素酶基因的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào),2013,48(9):1-4.

[4] 張禾璇,單可人,官志忠.報(bào)告基因研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J].國際遺傳學(xué)雜志,2013,36(1):6-12.

[5] Maita H,Tomita K,Ariga H. A split luciferase-based reporter for detection of a cellular macromolecular complex[J].Anal Biochem,2014,(452):1-9.

[6] 張金棟,呂景禮,李曉艷,等.整合熒光素酶的穩(wěn)定細(xì)胞克隆建立裸鼠肺癌靜脈移植瘤模型的探索[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(7):1055-1057.

[7] Lake M C,Aboagye E O.Luciferase fragment complementtation imaging in preclinical cancer studies[J].Oncoscience, 2014, 1(5):310-325.

[8] 李小穎,高凱,董偉,等.熒光素酶標(biāo)的人肝癌細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和PET-CT成像比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2011,(3):10-13.

Establishment of the animal model with human hepatoma cell labelled with luciferase

Objective:To establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase. Methods:1×106cells which constitutively expressing lueiferase were inoculated to liver of BALB／c-nu through hepatic portal vein for assessment of tumor growth with the whole-body optical imaging system.Results:Successfully establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase.Conclusion:Hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase can be successfully made,which is a new tool to further study the mechanism of metastasis and drug discovery.

Luciferase;hepatoma;animal model

R392.4

A

1008-1151(2015)06-0102-02

2015-05-12

廣西自然基金（2013gxnsfaa019253）；廣西科學(xué)技術(shù)開發(fā)與研究項(xiàng)目（桂科攻14124003-8）。

李海濱，男，中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)師，從事轉(zhuǎn)基因與克隆、分子生物學(xué)、移植免疫學(xué)研究。

孫煦勇，中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師。