楊 潔，韓 瑋，王永強(qiáng)，曹 方，丁厚中

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院1.肛腸外科，2.綜合外科，江蘇昆山215300）

轉(zhuǎn)移抑制因子1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

楊 潔1，韓 瑋2，王永強(qiáng)1，曹 方2，丁厚中2

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院1.肛腸外科，2.綜合外科，江蘇昆山215300）

目的：檢測(cè)轉(zhuǎn)移抑制因子1（metastasis suppressor 1，MTSS1）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）在結(jié)直腸癌中的表達(dá)變化及臨床意義。方法：在含有240例結(jié)直腸癌標(biāo)本的組織芯片上，利用免疫組織化學(xué)法及qRT-PCR法檢測(cè)MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌、癌旁組織中的表達(dá)，并分析與結(jié)直腸癌臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：結(jié)直腸癌組織中MTSS1陰性表達(dá)率和VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。MTSS1陰性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke′s分期相關(guān)（P＜0.05）；VEGF陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡（≥60歲）、腫瘤分化程度（低分化）相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：結(jié)直腸癌中MTSS1低表達(dá)和VEGF高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

結(jié)直腸癌；轉(zhuǎn)移抑制因子1；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

轉(zhuǎn)移抑制因子1（metastasis suppressor 1，MTSS1），是由Lee等［1］應(yīng)用mRNA差異展示技術(shù)研究膀胱癌轉(zhuǎn)移機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在正常膀胱組織中呈陽(yáng)性表達(dá)而在轉(zhuǎn)移性癌組織中表達(dá)缺失。對(duì)乳腺癌、前列腺癌、腎癌等組織模型的研究進(jìn)一步證實(shí)，MTSS1也是一種多功能的骨架蛋白［2-7］，但MTSS1抑制惡性腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全清楚。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）在成人和動(dòng)物的正常組織中合成很少，但在腫瘤、胎盤、黃體等存在新生血管的組織中呈高表達(dá)。在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞分泌大量VEGF，刺激腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的必需條件，在此過程中細(xì)胞骨架蛋白和血管因子起著重要作用。本研究探索MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)變化及其臨床病理的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集自2004年1月至2010年12月于江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院及吳江市人民醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)術(shù)后癌組織標(biāo)本共240例，所有病理診斷結(jié)果經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確認(rèn)，以距原發(fā)灶邊緣＞2 cm的癌旁黏膜組織作為對(duì)照。病理分型均為腺癌。Dukes分期：A期13例、B期132例、C期72例、D期23例。所有患者均無結(jié)直腸癌家族遺傳史，術(shù)前均未接受過放療和化療?；颊吲R床資料完整，包括年齡、性別、分化程度、浸潤(rùn)深度、Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。另選取江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院于2014年12月至2015年5月間4例結(jié)腸癌病例，患者均行結(jié)腸癌根治術(shù)，術(shù)前未行放療和化療，取術(shù)中切除的結(jié)腸癌及癌旁配對(duì)組織標(biāo)本共4對(duì)，均為知情同意。

1.2 試劑

MTSS1（英國(guó)Ca1tag-Medsystems），VEGF（美國(guó)Lab Vision），S-P免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，基因組RNA抽提試劑盒（BioTeKe公司），Ex TaqTMPCR及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)技術(shù)采用S-P法，切片脫蠟至水，PBS洗；高溫高壓修復(fù)抗原；按照S-P免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固；MTSS1鼠抗人單克隆抗體稀釋度為1∶50，VEGF鼠抗人多克隆抗體稀釋度為1∶200，PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

MTSS1及VEGF陽(yáng)性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞質(zhì)或胞膜。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占5個(gè)以上高倍鏡視野比例計(jì)數(shù)分為4類：＜5％為1分，5％～25％為2分，26％～50％為3分，＞50％為4分。染色強(qiáng)度分類：淡黃色為1分；黃或深黃色為2分；褐或棕褐色為3分。兩者計(jì)分乘積大于2為陽(yáng)性。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)4對(duì)配對(duì)組織中MTSS1 mRNA的表達(dá)

MTSS1基因引物序列參見文獻(xiàn)［1］；內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白引物序列：上游，5′-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，下游，5′-CCATCGTCCACCGCAAAT-3′，引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，再行94℃30 s、60℃30 s、72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠用Quantity-One圖像處理軟件行灰度分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件作統(tǒng)計(jì)處理。MTSS1和VEGF與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)

成功構(gòu)建含有240例結(jié)直腸癌的組織芯片。免疫組化結(jié)果顯示（圖1），MTSS1的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在癌旁組織中呈淡黃色至棕黃、棕褐色，彌漫分布，癌組織中染色較弱，呈弱陽(yáng)性或不著色，MTSS1在癌旁組織中的表達(dá)率為194/240（80.8％）。VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)或胞膜，癌旁組織中染色較弱，呈弱陽(yáng)性或陰性，癌組織中彌漫分布，染色較強(qiáng)，呈強(qiáng)陽(yáng)性，在癌組織中的表達(dá)率為184/240（76.7％）。

圖1 MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（SP×400）

2.2 MTSS1和VEGF與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

MISS1的陰性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陽(yáng)性）、Dukes分期（C～D期）相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、浸潤(rùn)深度及分化程度無關(guān)（P＞0.05）；VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡（≥60歲）、腫瘤分化程度（低分化）相關(guān)（P＜0.05），而與性別、浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 腸癌臨床病理參數(shù)與MTSS1及VEGF陽(yáng)性表達(dá)之間的關(guān)系

2.3 MTSS1 mRNA的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MTSS1 mRNA在癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯降低（t=-7.264，P＜0.05）。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌和癌旁組織中MTSS1 mRNA的表達(dá)

3 討論

MTSS1包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括N端的胰島素受體酪氨酸激酶底物p53同源結(jié)構(gòu)域（IMD）、C端的WASP同源結(jié)構(gòu)域2（WH2）及富含谷氨酸、脯氨酸、蘇氨酸殘基的中央?yún)^(qū)域［2］。IMD與WH2相似，可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使細(xì)胞膜變形形成絲狀或偽足樣突起及膜多極化［3］。而MTSS1的中央?yún)^(qū)域則主要起腳手架蛋白的作用，與細(xì)胞信號(hào)通路中的多種受體蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子等結(jié)合，參與肌動(dòng)蛋白等相關(guān)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞核形成及微絲分支穩(wěn)定性［4］。MTSS1主要定位于細(xì)胞間連接，與肌動(dòng)蛋白關(guān)系密切，在細(xì)胞骨架的形成、強(qiáng)化及維持中起重要作用［5］。在腫瘤發(fā)生中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞骨架成分分布不均及E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附力減弱可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移［6］。MTSS1可通過加強(qiáng)細(xì)胞間連接的強(qiáng)度，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［7］。MTSS1缺失可致細(xì)胞連接間的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架斷裂，細(xì)胞解聚能力增加，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［8］。但MTSS1作為腫瘤抑制基因目前仍存在爭(zhēng)議，研究表明MTSS1在不同惡性腫瘤中呈不同的表達(dá)，如肝癌、結(jié)腸癌中呈高表達(dá)［9-10］，胰腺癌、肝門部膽管癌等呈低表達(dá)［11-13］。

本研究結(jié)果表明，MTSS1在結(jié)直腸癌組織中主要呈陰性表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陽(yáng)性）、Dukes分期（C～D期）等終末期事件相關(guān)，提示MTSS1低表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。Wang等［10］應(yīng)用免疫組化檢測(cè)135例結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)，MTSS1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)且與組織浸潤(rùn)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，與本研究結(jié)果相反，我們認(rèn)為可能是由于同種抗體不同的克隆反應(yīng)引起的。VEGF在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高，為184/240（76.7％），且與患者年齡（≥60歲）、腫瘤分化程度（低分化）相關(guān)，提示新生血管形成的微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞低分化及個(gè)體差異的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。VEGF表達(dá)與性別、浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期無相關(guān)性。新近關(guān)于VEGF與結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)［14］，VEGF的高表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與本研究結(jié)果不盡相同，可能是由于樣本量及個(gè)體差異引起的。

綜上，MTSS1和VEGF可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，已證實(shí)VEGF為腫瘤的獨(dú)立預(yù)后因素，而關(guān)于MTSS1在腫瘤中如何發(fā)揮作用目前仍未完全闡明，其與VEGF的相關(guān)性仍有待多種骨架蛋白與多種VEGF共同驗(yàn)證。

［1］ Lee YG，Macoska JA，Korenchuk S，et a1.MIM，a potentia1 metastasis suppressor gene in b1adder cancer［J］. Neop1asia，2002，4（4）：291-294.

［2］ Nixdorf S，Grimm MO，Loberg R，et a1.Expression and regu1ation of MIM（Missing In Metastasis），a nove1 putative metastasis suppressor gene，and MIM-B，in b1adder cancer ce11 1ines［J］.Cancer Lett，2004，215（2）：209-220.

［3］ Matti1a PK，Sa1minen M，Yamashiro T，et a1.Mouse MIM，a tissue-specific regu1ator of cytoske1eta1 dynamics，interacts with ATP-actin monomers through its C-termina1 WH2 domain［J］.J Bio1 Chem，2003，278（10）：8452-8459.

［4］ Saarikangas J，Matti1a PK，Varjosa1o M，et a1.Missingin-metastasis MIM/MTSS1 promotes actin assemb1y at interce11u1ar junctions and is required for integrity of kidney epithe1ia［J］.J Ce11 Sci，2011，124（Pt 8）：1245-1255.

［5］ Kedmi M，Ben-Chetrit N，K?rner C，et a1.EGF induces microRNAs that target suppressors of ce11 migration：miR-15b targets MTSS1 in breast cancer［J］.Sci Signa1，2015，8（368）：ra29.

［6］ Dawson JC，Bruche S，Spence HJ，et a1.Mtss1 promotes ce11-ce11 junction assemb1y and stabi1ity through the sma11 GTPase Rac1［J］.PLoS One，2012，7（3）：e31141.

［7］ Chen Q，Chen L，Zhao R，et a1.Microarray ana1yses revea1 1iver metastasis-re1ated genes in metastatic co1orecta1 cancer ce11 mode1［J］.J Cancer Res C1in Onco1，2013，139（7）：1169-1178.

［8］ Mertz KD，Pathria G，Wagner C，et a1.MTSS1 is a metastasis driver in a subset of human me1anomas［J］. Nat Commun，2014，5：3465.

［9］ Liu S，Guo W，Shi J，et a1.MicroRNA-135a contributes to the deve1opment of porta1 vein tumor thrombus by promoting metastasis in hepatoce11u1ar carcinoma［J］.J Hepato1，2012，56（2）：389-396.

［10］ Wang D，Xu MR，Wang T，et a1.MTSS1 overexpression corre1ates with poor prognosis in co1orecta1 cancer［J］.J Gastrointest Surg，2011，15（7）：1205-1212.

［11］ Zhou L，Li J，Shao QQ，et a1.Expression and significances of MTSS1 in pancreatic cancer［J］.Patho1 Onco1 Res，2015.［Epub ahead of print］

［12］ Wang F，Liu Y，Zhang H.Loss of MTSS1 expression is an independent prognostic factor for Hi1ar cho1angiocarcinoma［J］.Patho1 Onco1 Res，2013，19（4）：815-820.

［13］ Kukreja I，Kapoor P，Deshmukh R，et a1.VEGF and CD 34：A corre1ation between tumor angiogenesis and microvesse1 density-an immunohistochemica1 study［J］. J Ora1 Maxi11ofac Patho1，2013，17（3）：367-373.

［14］ 史剛剛，郝敬鵬，王力，等.結(jié)直腸癌組織中血管抑制蛋白1表達(dá)的臨床意義及其與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A和微血管密度的相關(guān)性［J］.中華胃腸外科雜志，2015，18（3）：272-276.

Expression and significance of metastasis suppressor 1 and vascular endothelial growth factor in colon cancer

YANG Jie1，HAN Wei2，WANG Yong-qiang1，CA0 Fang2，DING Hou-zhong2
（1.Department of Anorecta1 Surgery，2.Department of Genera1 Surgery，Kunshan Hospita1 Affi1iated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300，China）

Objective：To investigate expression of metastasis suppressor 1（MTSS1）and vascu1ar endothe1ia1 growth factor（VEGF）and their prognostic significance in co1on cancer.Methods：We constructed tissue microarray b1ocks containing co1on cancer specimens from 240 patients.Expression of MTSS1 and VEGF in the specimens were ana1yzed using immunohistochemistry（IHC）technique and qRT-PCR.And their corre1ation with c1inica1 parameters were ana1ysed.Results：The negative expression rate of MTSS1 and the positive expression rate of VEGF was much higher in co1on cancer than in adjacent tissue（P＜0.05）.Negative MTSS1 expression was significant1y associated with presence of 1ymph node metastasis and advanced Duke′s stages（P＜0.05）.The over-expression of VEGF had a significant re1ationship with age（≥60 years）and poor1y differentiation（P＜0.05）.Conclusion：Decreased expression of MTSS1 and overexpression of VEGF may be re1ated to the the deve1opment and metastasis of co1on cancer.

co1on cancer；metastasis suppressor 1；vascu1ar endothe1ia1 growth factor

R735.3

A

1671-7783（2015）06-0520-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150207

2015-09-17 ［編輯］ 劉星星

楊潔（1982—），女，江蘇昆山人，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤方向的研究；丁厚中（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mai1：dinghouzhong@163.com