劉亞南，高愛華，朱維培

（蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州215000）

上皮性卵巢癌組織中ASAP1蛋白的表達及其臨床意義

劉亞南，高愛華，朱維培

（蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州215000）

目的：探討ASAP1蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床意義。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測73例上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織石蠟切片中ASAP1蛋白的表達。采用χ2檢驗分析ASAP1表達與卵巢癌患者病理資料間的關(guān)系。并采用Kap1an-Meier進行單因素生存分析，比較不同ASAP1蛋白表達水平的卵巢癌患者的預(yù)后。結(jié)果：ASAP1蛋白表達與腹腔積液量相關(guān)（P=0.005）；單因素生存分析顯示，ASAP1蛋白高表達組與低表達組總生存時間、無復(fù)發(fā)生存時間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005，0.001）。結(jié)論：ASAP1蛋白高表達是上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良的高危因素。

ASAP1；上皮性卵巢癌；免疫組化

上皮性卵巢癌是常見的婦科腫瘤，2008年全球約有225 500卵巢癌新增病例，死亡約140 200例［1］。卵巢癌患者的生存率與腫瘤細胞的擴散及轉(zhuǎn)移相關(guān)。ASAP1［a phosphatidy1inosito1 4，5-bisphosphate-dependent Arf GTPase-activating protein（Arf GAP）］是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸依賴Arf（ADP糖基化因子）的GTP激活蛋白，與細胞的黏附和樹突狀偽足形成有關(guān)［2］。文獻報道，近來有ASAP1的表達與前列腺癌及宮頸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)［3-4］。目前國內(nèi)暫無ASAP1蛋白在卵巢癌轉(zhuǎn)移方面的相關(guān)研究報道，因此，本研究通過免疫組化法檢測卵巢癌組織中ASAP1的表達，分析ASAP1與上皮性卵巢癌患者臨床指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系，初步探討ASAP1在上皮性卵巢癌發(fā)展以及預(yù)后判斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2004年1月至2008年12月在我院行全面分期手術(shù)或腫瘤細胞減滅術(shù)、經(jīng)病理證實具有完整病歷和隨訪資料的上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織蠟塊73例，患者術(shù)前未接受化療?；颊吣挲g22～75歲，平均50.75歲；病理類型：漿液性癌44例，非漿液性癌29例。按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2000年的手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期16例，Ⅱ期5例，Ⅲ期45例，Ⅳ期7例；病理分化程度：低分化26例，高分化47例。本實驗所采用的石蠟標(biāo)本均取得患者的知情同意。以因子宮肌瘤行子宮加附件切除患者的正常卵巢組織標(biāo)本為對照。

1.2 免疫組化檢測ASAP1蛋白表達

采用SP法，所有標(biāo)本經(jīng)10％甲醛固定，石蠟包埋，選擇具有代表性的組織蠟塊進行4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，加1∶100 ASAP1一抗小鼠抗人單抗（美國Abcam公司）4℃過夜，二抗1∶200生物素化的抗小鼠抗體（丹麥Dako公司）室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

由2位病理醫(yī)師進行獨立雙盲評分，每張切片在400倍鏡下隨機選擇5個腫瘤細胞區(qū)，每個區(qū)域觀察100個腫瘤細胞。光鏡下ASAP1陽性表達主要分布于細胞核及細胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒作為陽性結(jié)果，將所選取區(qū)域中細胞的染色范圍和染色強度參考文獻［5］標(biāo)準(zhǔn)進行半定量化，①染色強度的評分標(biāo)準(zhǔn)：未染色為0分，淡黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。②染色范圍計分以陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例計算：陽性細胞率＜5％計0分，6％～10％計1分，11％～50％計2分，51％～80％計3分，≥80％計4分。染色結(jié)果總分為染色強度與染色范圍計分的乘積，0～4分為低表達，6～12分為高表達。

1.4 隨訪

對73例卵巢癌患者進行隨訪，隨訪截止時間為2013年6月，隨訪時間為2.6～107個月（中位隨訪時間為29.2個月）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗分析ASAP1表達與卵巢癌患者病理資料間的關(guān)系。采用Kap1an-Meier和Log-rank檢驗進行單因素生存分析，比較ASAP1蛋白高表達和低表達卵巢癌患者的預(yù)后。

2 結(jié)果

2.1 ASAP1蛋白在卵巢癌組織中的表達

ASAP1蛋白的表達主要位于細胞核與細胞質(zhì)，呈棕色，見圖1。根據(jù)ASAP1蛋白的表達將卵巢癌患者分為2組：ASAP1蛋白低表達組37例，ASAP1蛋白高表達組36例。

圖1 ASAP1蛋白的表達（×400）

2.2 ASAP1蛋白表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

ASAP1蛋白的表達與卵巢癌患者的腹腔積液量相關(guān)（P=0.005），與患者年齡、腫瘤分期、病理類型、腫瘤分化無關(guān)（P均＞0.05），見表1。

2.3 ASAP1蛋白不同表達水平的上皮性卵巢癌患者預(yù)后分析

隨訪期間共有21例死亡，患者的總生存時間為2.6～107個月，中位生存時間為29.2個月，無瘤生存時間為2.6～107個月，中位無復(fù)發(fā)生存時間為22個月。單因素生存分析顯示，ASAP1蛋白高表達組與低表達組間總生存時間與無進展時間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005，0.001）。見圖2、3。

3 討論

ASAP1相對分子質(zhì)量約為125 000，位于染色體8q24，與細胞的黏附和樹突狀偽足形成有關(guān)，敲除ASAP1或沉默ASAP1基因，樹突狀偽足的形成及黏附現(xiàn)象則消失［6-10］。ASAP1與腫瘤的發(fā)展與侵襲有關(guān)。Eh1ers等［11］報道，在惡性黑色素瘤中，ASAP1表達與促進細胞的侵襲能力有關(guān)。Mü11er等［12］研究表明，在動物實驗中ASAP1能促進直腸癌的轉(zhuǎn)移，在體外實驗中ASAP1能促進直腸癌細胞的侵襲。本研究表明，ASAP1的表達與腹盆腔內(nèi)腹腔積液量相關(guān)。卵巢癌患者有腹腔積液是預(yù)后不良的高危因素，腹腔積液的產(chǎn)生是晚期患者的特征［13］。本課題組前期也有研究表明，隨著卵巢癌患者臨床分期的增加，腹腔積液量也有增加的趨勢，卵巢癌腹腔積液與腫瘤的惡性程度相關(guān)，惡性程度高者易形成腹腔積液，預(yù)后差［14］。卵巢癌患者癌細胞可阻塞淋巴管，暫時阻擋癌細胞向腹膜外轉(zhuǎn)移，但同時可促進腹腔積液的產(chǎn)生，腫瘤轉(zhuǎn)移至腹膜和大網(wǎng)膜時引起局部刺激，使血漿蛋白滲漏至腹腔形成腹腔積液。ASAP1可被Arf1募集至細胞周邊，與細胞的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)。ASAP1通過阻斷Arf1活性增強細胞的活動性，ASAP1高表達組易形成腹腔積液，考慮與ASAP1促進卵巢癌細胞局部黏附，調(diào)節(jié)跨膜轉(zhuǎn)運及細胞支架重塑有關(guān)。上述研究證明，ASAP1在惡性腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用。本研究中ASAP1蛋白的表達與患者年齡、腫瘤分期、病理類型、腫瘤分化無關(guān)。

表1 上皮性卵巢癌組織中ASAP1表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 ASAP1高低表達上皮性卵巢癌患者的總生存曲線

圖3 ASAP1高低表達上皮性卵巢癌患者的無復(fù)發(fā)生存曲線

本研究結(jié)果還顯示，ASAP1高表達患者總生存時間及無復(fù)發(fā)時間較ASAP1低表達患者短。由此提示ASAP1高表達是上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良的高危因素，ASAP1不僅可作為卵巢癌的潛在標(biāo)志物，而且促進上皮性卵巢腫瘤的侵襲，但分子機制有待進一步研究。研究表明，ASAP1高表達致上皮生長因子受體增多，與卵巢癌的進展有關(guān)［15］。Baron等［16］研究結(jié)果表明，ASAP1高表達使腫瘤細胞遷徙及轉(zhuǎn)移與血小板衍生生長因子（PDGF）介導(dǎo)的細胞通路有關(guān)。ASAP1的SH3結(jié)構(gòu)域可以與Src介導(dǎo)的細胞通路結(jié)合，與腫瘤細胞的偽足形成有關(guān)［17］。

本研究初步表明ASAP1可作為預(yù)測卵巢癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物，但其在卵巢癌發(fā)展過程中的分子機制仍需進一步研究。

［1］ Wang B，Liu SZ，Zheng RS，et a1.Time trends of ovarian cancer incidence in China［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（1）：191-193.

［2］ Bharti S，Inoue H，Bharti K，et a1.Src-dependent phosphory1ation of ASAP1 regu1ates podosomes［J］.Mo1 Ce11 Bio1，2007，27（23）：8271-8283.

［3］ Lin D，Watahiki A，Bayani J，et a1.ASAP1，a gene at 8q24，is associated with prostate cancer metastasis［J］. Cancer Res，2008，68（11）：4352-4359.

［4］ Pecore11i S，Zig1iani L，Odicino F.Revised FIGO staging for carcinoma of the cervix［J］.Int J Gynaeco1 Obstet，2009，105（2）：107-108.

［5］ 馮兆億，溫宏武，廖秦平.卵巢上皮性癌組織中Notch1、Jagged1和NICD蛋白表達的意義及癌細胞中γ-分泌酶活性的初步探討［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2014，49（10）：780-786.

［6］ Carragher NO，F(xiàn)rame MC.Foca1 adhesion and actin dynamics：a p1ace where kinases and proteases meet to promote invasion［J］.Trends Ce11 Bio1，2004，14（5）：241-249.

［7］ Liu Y，Loijens JC，Martin KH，et a1.The association of ASAP1，an ADP ribosy1ation factor-GTPase activating protein，with foca1 adhesion kinase contributes to the process of foca1 adhesion assemb1y［J］.Mo1 Bio1 Ce11，2002，13（6）：2147-2156.［8］ Liu Y，Yerusha1mi GM，Grigera PR，et a1.Mis1oca1ization or reduced expression of Arf GTPase-activating protein ASAP1 inhibits ce11 spreading and migration by inf1uencing Arf1 GTPase cyc1ing［J］.J Bio1 Chem，2005，280（10）：8884-8892.

［9］ Wang J，Morita Y，Maze1ova J，et a1.The Arf GAP ASAP1 provides a p1atform to regu1ate Arf4-and Rab11-Rab8-mediated ci1iary receptor targeting［J］.EMBO J，2012，31（20）：4057-4071.

［10］ Randazzo PA，Andrade J，Miura K，et a1.The Arf GTPase-activating protein ASAP1 regu1ates the actin cytoske1eton［J］.Proc Nat1 Acad Sci U S A，2000，97（8）：4011-4016.

［11］ Eh1ers JP，Wor1ey L，Onken MD，et a1.DDEF1 is 1ocated in an amp1ified region of chromosome 8q and is overexpressed in uvea1 me1anoma［J］.C1in Cancer Res，2005，11（10）：3609-3613.

［12］ Mü11er T，Stein U，Po1etti A，et a1.ASAP1 promotes tumor ce11 moti1ity and invasiveness，stimu1ates metastasis formation in vivo，and corre1ates with poor surviva1 in co1orecta1 cancer patients［J］.Oncogene，2010，29（16）：2393-2403.

［13］ Gawrychowski K，Szewczyk G，Skopińska-Róz·ozewska E，et a1.The angiogenic activity of ascites in the course of ovarian cancer as a marker of disease progression［J］. Dis Markers，2014，2014：683757.

［14］ 任瓊珍，胡建銘.卵巢癌腹水形成的相關(guān)因素的分析［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2004，24（2）：264-265.

［15］ Kowanetz K，Husnjak K，Ho11er D，et a1.CIN85 associates with mu1tip1e effectors contro11ing intrace11u1ar trafficking of epiderma1 growth factor receptors［J］.Mo1 Bio1 Ce11，2004，15（7）：3155-3166.

［16］ Baron AT，Wi1ken JA，Haggstrom DE，et a1.C1inica1 imp1ementation of so1ub1e EGFR（sEGFR）as a theragnostic serum biomarker of breast，1ung and ovarian cancer［J］.IDrugs，2009，12（5）：302-308.

［17］ Ju1iano RL.Signa1 transduction by ce11 adhesion receptors and the cytoske1eton：functions of integrins，cadherins，se1ectins，and immunog1obu1in-superfami1y members［J］.Annu Rev Pharmaco1 Toxico1，2002，42：283-323.

Expression and clinical significance of ASAP1 in epithelial ovarian carcinoma

LIU Ya-nan，GA0 Ai-hua，ZHU Wei-pei
（Department of Obstetrics and Gyneco1ogy，the Second Affi1iated Hospita1 of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215000，China）

Objective：To exp1ore the expression and c1inica1 significance of ASAP1 in epithe1ia1 ovarian carcinoma（EOC）.Methods：The expression 1eve1 of ASAP1 in 73 paraffin-embedded EOC specimen was measured by immunohistochemistry staining.Statistica1 ana1ysis was performed to eva1uate the c1inicopatho-1ogic significance of ASAP1.Assemb1ed c1inica1 surviva1 data were ana1yzed with Kap1an-Meier curves.Results：Statistica1 ana1ysis disp1ayed a significant corre1ation in ASAP1 expression with ascitic f1uid（P= 0.005）.High expression of ASAP1 was corre1ated with poor overa11（P=0.005）and recurrence-free（P=0.001）surviva1 in patients with EOC.Conclusion：E1evated expression of ASAP1 may be used as a potentia1 marker of EOC patients.

ASAP1；epithe1ia1 ovarian carcinoma；immunohistochemistry

R737.31

A

1671-7783（2015）06-0495-03

10.13312/j.issn.1671-7783.y150187

2015-08-24 ［編輯］ 劉星星

劉亞南（1983—），女，湖北武漢人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤診治研究；朱維培（通訊作者），主任醫(yī)師，E-mai1：zwp333xx@126.com