徐曉南, 方 謙, 彭 偉, 盧淑娟, 翟亞男, 劉慶輝, 王吉天

(華北理工大學口腔醫(yī)學院, 河北 唐山 063000)

綠茶浸提液對釉質再礦化作用的體外研究

徐曉南, 方 謙, 彭 偉, 盧淑娟, 翟亞男, 劉慶輝, 王吉天

(華北理工大學口腔醫(yī)學院, 河北 唐山 063000)

目的: 體外觀察綠茶浸提液對早期釉質齲的再礦化作用。方法：選擇新鮮拔除的牛健康切牙并制備成釉質塊，建立人工齲模型后，隨機分為綠茶浸提液組、含氟牙膏組(n=5)和去離子水組(n=5)，其中綠茶浸提液分為0.1、0.05、0.03 g/mL 3個濃度組(n=5)，各組均進行再礦化處理；SEM觀察再礦化前后釉質表面形態(tài)，X射線能譜儀分析釉質表面再礦化前后鈣磷比。結果：SEM觀察結果顯示，隨著綠茶浸提液濃度的增加釉質表面的結構更加致密均勻，釉質表面的沉積物較含氟牙膏組更為均勻光滑；能譜儀分析結果顯示，各組間鈣磷比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；各濃度綠茶浸提液組的鈣磷比值均高于含氟牙膏組。結論：綠茶浸提液能夠促進脫礦釉質再礦化，其再礦化效果優(yōu)于普通含氟牙膏。

綠茶浸提液; 釉質; 再礦化; 掃描電鏡

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.10.006

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(10): 602]

齲病是在以細菌為主的多因素作用下，牙體硬組織發(fā)生慢性進行性破壞的一種疾病。早期釉質齲主要表現(xiàn)為釉質表層下脫礦、微晶結構改變，臨床上可見釉質透明度下降，呈白堊色。對早期釉質齲的治療主要采用非手術方法，即通過再礦化治療使脫礦的釉質再次礦化，以恢復其硬度并終止齲損的進一步發(fā)展[1]。目前用于再礦化的制劑有氟化物、五倍子和茶多酚等，其中含氟牙膏應用較為廣泛，但兒童誤吞誤咽則會引起急、慢性氟中毒，過量使用也可引起氟牙癥、氟骨癥[2], 其安全系數(shù)有待評價。而茶是世界上三大不含酒精的飲料之一，具有保健作用，近來有研究認為茶可防齲，其防齲的有效成分主要是氟和茶多酚[3-5]。茶多酚具有抑菌作用，且普通綠茶的抑菌作用較好[6]，但茶葉促進早期釉質齲再礦化作用的研究鮮有報道。本實驗通過研究綠茶浸提液對脫礦牛牙釉質再礦化的作用，為進一步分析綠茶浸提液的防齲機制提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

綠茶(漳州天福茶葉); 含氟牙膏(含氟量0.14%)(高露潔，美國)；脫礦液配方[3]: 2.2 mmol/L Ca(NO3)2、2.2 mmol/L KH2PO4、50 mmol/L CH3COOH、5.0 mmol/L NaN3、0.5 mg/L NaF，pH為4.5；人工唾液配方(ISO/TR10271標準)：氯化鈉0.4 g、氯化鉀0.4 g、無水氯化鈣0.795 g、磷酸二氫鈉0.78 g、硫化鈉0.005 g、尿素1 g、去離子水稀釋至1 000 mL，pH為7.0；掃描電鏡(日立，日本)；X射線能譜儀(Thermo Fisher，美國)；高速硬組織切割機(Struers，丹麥)；體視顯微鏡(徠卡，德國)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興)。

1.2 標本的選擇和制備

選擇新鮮拔除的無齲損、無釉質發(fā)育不全、無裂痕的牛切牙35個，去除根部軟組織，清洗消毒后4 ℃保存?zhèn)溆?。用碳化硅砂紙在去離子水流下拋光唇面，硬組織片切輪將冠部切成4 mm×4 mm×2 mm的釉質塊35個，除唇側釉質面外均涂上雙層抗酸指甲油。隨機選出5個標本作為正常對照組進行掃描電鏡觀察。

1.3 方法

1.3.1 釉質齲模型的建立

將預備好的30個標本放入盛有脫礦液的玻璃瓶中，釉質表面面積與溶液的比率為2 mm2·mL-1，在37 ℃恒溫箱中持續(xù)浸泡3 d，每天換新鮮脫礦液，釉質面呈明顯白堊色即人工齲模型建立成功。隨機抽取5個標本作為脫礦對照組，觀察脫礦后釉質塊表面形態(tài)結構的改變及測量鈣磷比值。

其余25個脫礦釉質標本隨機分為3個實驗組，A組：綠茶浸提液組(n=15)；B組：含氟牙膏組(n=5)；C組：去離子水組(n=5)。綠茶浸提液組按濃度梯度分為A1 、A2 、A3小組，濃度分別為0.1、0.05、0.03 g/mL(n=5)。

1.3.2 綠茶浸提液和含氟牙膏液的配置

綠茶浸提液：稱取16、8、10 g茶葉并搗碎，分別加入160、160、300 mL的去離子水煮沸15 min，用200目尼龍布過濾，沉淀后取濾液，沉淀部分再按上述同樣的方法連續(xù)提取2次并取濾液，將每次所得濾液分別各自集中在一起即濃度為0.1、0.05、0.03 g/mL的浸提液。

含氟牙膏液：稱4 g牙膏加入40 mL去離子水中，快速單方向攪拌至完全溶解，靜置取上清液,即濃度為0.1 g/mL的含氟牙膏液。

1.3.3 再礦化處理

將各實驗組標本分別放入相應處理液中浸泡,2次/d(早、晚各1次，1 h/次)，共處理10 d。然后去離子水沖洗其表面1 min，浸泡于人工唾液中(去離子水組除外)，置于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3.4 SEM觀察釉質表面形態(tài)結構的改變

將各組釉質塊固定在SEM載物臺上，抽真空噴金，觀察正常釉質及各組再礦化前后的釉質表面形態(tài)(20 kV、×1 000)。

1.3.5 能譜分析儀分析釉質表面的元素

在各樣本的觀察界面上隨機選取3個點，用X射線能譜分析儀進行點掃描，分析釉質表面的元素含量，并計算鈣磷比值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)輸入和分析，各組間鈣磷比值的比較選用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 肉眼觀察

釉質塊樣本脫礦后釉質表面粗糙，失去光澤，呈白堊色。再礦化液處理后，綠茶浸提液組釉質表面為棕黃色; 去離子水和含氟牙膏組釉質表面未見著色，其中含氟牙膏組釉質表面白堊色改變減輕。

2.2 釉質脫礦和再礦化后的SEM觀察結果

正常釉質表面光滑、均一(圖1a)，脫礦后可見釉質表面呈蜂窩狀改變，釉柱中心溶解，部分釉柱間質破壞，大部分出現(xiàn)孔隙樣凹陷(圖1b)。去離子水組釉質表面仍有大量蜂窩狀空隙，少量空隙有碎屑沉積(圖1c)。經(jīng)不同濃度綠茶浸提液處理后的釉質表面可見排列凌亂的球形微粒沉積，未見蜂窩狀凹陷，綠茶浸提液濃度越高，則微粒數(shù)量越多，排列越密實均勻(圖d～f)。含氟牙膏組釉質表面粗糙，其表面沉積的顆粒較大，形狀不規(guī)則(圖1g)。

a.正常釉質b.脫礦釉質c.去離子水組d.0.1g/mL綠茶浸提液組

e.0.05g/mL綠茶浸提液組 f.0.03g/mL綠茶浸提液組 g.含氟牙膏組

圖1 各組釉質表面形態(tài)的觀察(SEM，×1 000)

2.3 X射線能譜儀分析結果

單因素方差分析顯示，各組標本分別經(jīng)含氟牙膏、綠茶浸提液、去離子水處理后，釉質表面鈣磷比差異顯著(F=1641.089，P=0.000)；兩兩比較顯示，除去離子水組與脫礦組的鈣磷比值差異無統(tǒng)計學差異(P=1.000)外，其他各組間鈣磷比均具有統(tǒng)計學差異(P=0.000)，其中0.1 g/mL的綠茶浸提液組的鈣磷比值最高(表1)。

表1 脫礦釉質經(jīng)不同處理液處理后鈣磷比的比較 ±s)

*與脫礦組相比P﹥0.05

3 討論

人工致齲的方法分為口內法、化學致齲法、電化學法、細菌產(chǎn)酸致齲法和人工口腔模型。本實驗采用的是化學致齲法，即先用脫礦液使釉質脫礦，再采用pH循環(huán)法模擬人的口腔環(huán)境來進行再礦化處理，模擬了齲病的主要發(fā)生發(fā)展過程，對綠茶浸提液促進早期釉質齲再礦化的研究有一定的意義。早期釉質齲的臨床表現(xiàn)為牙齒表面出現(xiàn)白堊色不透明斑點，且牙體表面外形仍完整[7]。本實驗中牛牙釉質塊經(jīng)脫礦液處理后均成白堊色，提示早期釉質齲的形成。

本結果顯示，隨著綠茶浸提液濃度的增加，脫礦釉質塊表面結構越致密均勻，且釉質表面的鈣磷比值隨之增高。提示，高濃度的綠茶浸提液促進脫礦釉質再礦化的效果較低濃度的好，這可能與茶葉中所含的氟離子有關。茶葉釋放的氟離子部分粘附在牙齒表面的菌斑內，從而抑制致齲細菌的生長和代謝；部分氟離子通過釉質的微孔結構進入釉質內部，取代羥基磷灰石形成氟磷灰石，從而增強釉質抗酸蝕的能力；氟離子可與唾液及釉質溶解產(chǎn)生的鈣離子結合，形成氟化鈣沉積層，其遇酸可緩慢溶解、釋放氟離子[8]。由圖1d可見，釉質塊經(jīng)高濃度綠茶浸提液處理后，其釉質表面分布的大小均勻致密的球狀顆?？赡転榉}，這一形態(tài)特點與Petzold[9]報道的氟化釉質表面的沉積物呈球形相符合。

對釉質表面的成分分析可采用電子探針顯微分析儀、原子光譜分析法、電子能譜分析法和分子光譜分析法等。而在釉質的再礦化實驗中常用X線能譜量化表面鈣、磷的相對含量，從而評估再礦化結果[10]。釉質發(fā)育不全的牙面鈣離子含量較正常牙低，其抗酸溶解能力也隨之下降。有學者發(fā)現(xiàn)，釉質發(fā)育不全與齲損的發(fā)生具有顯著相關性，從而推測釉質發(fā)育不全者更易患齲病[11]。本實驗在體外pH循環(huán)下進行，標本在脫礦液中浸泡的時間相對較長，最后形成的Ca/P比值也較高。提示，釉質表面經(jīng)過高濃度的綠茶浸提液處理后，其抗酸能力增強，對釉質具有保護作用， 與黎淑芳等[12]研究結果相一致。本結果顯示，在相同濃度下，綠茶浸提液組的鈣磷比值高于含氟牙膏組，且釉質表面的沉積物更為均勻光滑，說明綠茶浸提液促進脫礦釉質再礦化效果優(yōu)于含氟牙膏。雖然綠茶能治療早期釉質齲，但其能使牙面著色，且隨茶濃度的增加而加深。因此可選用低色素或低濃度的綠茶，及時清潔口腔，避免牙齒著色。

綠茶的成分較為復雜，含有酚類、蛋白質、芳香物質、生物堿、維生素與色素類、礦物質、微量元素等。但目前認為其主要防齲活性成分為氟和茶多酚。茶多酚為茶葉的重要組成部分，占25%，其作用是抑制致齲菌的生長發(fā)育，抑制變異鏈球菌的粘附和聚集，進而控制菌斑[13]。劉鑫等[14]發(fā)現(xiàn)綠茶的pH高于脫礦臨界值，對牛牙釉質的脫礦程度較其他種類茶及人工唾液小。有研究發(fā)現(xiàn)，多形性茶多酚與氟混合處理牙面可促進鈣鹽沉積，從而提高釉質的抗酸能力[15]；而李繼遙等[16]認為茶多酚對釉質脫礦和再礦化無明顯的抑制或促進作用, 同氟亦無協(xié)同作用，其抗齲作用是通過抗菌和抗菌斑作用實現(xiàn)的。本結果顯示，綠茶能夠促進脫礦釉質再礦化。而綠茶的防治齲的機制可能與氟離子的抗齲機制相關，也可能是茶多酚與氟的協(xié)同作用，有待進一步的驗證。

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The effects of green tea water extracts on the remineralization of enamel: an in vitro study

XU Xiao- nan, FANG Qian, PENG Wei, LU Shu- juan, ZHAI Ya- nan, LIU Qing- hui,WANG Ji- tian

(CollegeofStomatology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

AIM: To investigate the remineralization effect of green tea water extracts on early enamel caries. METHODS: Enamel blocks were made from freshly extracted bovine teeth and were demineralized in deminaralizing solution to establish early enamel caries. The blocks were treated by different green tea extracts at 0.1, 0.05 and 0.03 g/mL, fluoride toothpaste and distilled deionized water for 1 h respectively(n=5). Afterwards, the blocks were incubated in artificial saliva for 10 d. The Surface morphology of the samples was observed by scanning electron microscopy. Calcium and phosphorus contents were examined by X- ray energy spectrum analysis. RESULTS: The enamel surface structure in green tea extract groups was more compact and uniform. Green tea extracts dose- dependently increased the ratio of calcium and phosphorus in the enamel. X- ray energy spectrum analysis showed that green tea extract groups had significantly higher calcium/phosphorus ratio than the fluoride tooth paste group and distilled deionized water group (P<0.05). CONCLUSION: Green tea extracts have stronger remineralizing effects on demineralized enamel than fluoride toothpaste.

green tea extracts; enamel; remineralization; SEM

2015-04-27;

2015-08-12

國家大學生創(chuàng)新訓練項目(201310081011)

徐曉南(1992-),女,漢族, 河北人。本科生(指導老師：彭偉)

彭 偉，E-mail:pengwei1968@sina.com

R780.1

A

1005-2593(2015)10-0602-04