呂孝帥, 李正茂, 楊雪超

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣州口腔疾病研究所·口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510140)

·基礎(chǔ)研究·

生物活性玻璃58S/絲素蛋白膜促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞增殖與分化

呂孝帥, 李正茂, 楊雪超

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣州口腔疾病研究所·口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510140)

目的: 研究生物活性玻璃58S/絲素蛋白(BG58S/SF)膜對(duì)人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)增殖、分化的影響。方法：制備純SF膜(A組)和1 mg/mL(B組)、 5 mg/mL(C組)BG58S/SF膜預(yù)孵育24 h后分別接種hDPSCs。于培養(yǎng)4、7、14、21 d時(shí)，CCK-8法檢測(cè)hDPSCs的增殖能力；掃描電鏡和熒光染色觀察hDPSCs在膜材料表面的粘附和增殖狀態(tài)；ALP活性試驗(yàn)評(píng)估hDPSCs的分化潛能；Real-Time PCR檢測(cè)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化特異性相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果：hDPSCs在純SF膜和BG58S/SF膜材料上粘附良好；從第7天起,與A組相比，B、C組細(xì)胞ALP活性顯著增高, hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化特異性相關(guān)基因表達(dá)水平上調(diào)更加顯著(P<0.05), 且C組均高于B組。結(jié)論：BG58S/SF膜能促進(jìn)hDPSCs粘附、增殖與分化。

生物活性玻璃; 絲素蛋白; 牙髓干細(xì)胞; 組織工程

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.10.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(10): 577]

生物材料的發(fā)展已具有眾多優(yōu)良特性，但合成材料仍無(wú)法完全替代天然組織的所有功能，因此組織工程成為修復(fù)組織和器官缺損的理想方式。Hench首次發(fā)現(xiàn)生物活性玻璃(Bioactivity glass, BG)，因其同時(shí)具有骨引導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，可控的生物降解性，良好的機(jī)械性能和較高的生物活性被廣泛應(yīng)用于組織工程研究[1]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BG可通過(guò)釋放離子選擇性表達(dá)成骨相關(guān)基因、上游轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、信號(hào)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活動(dòng)[2]，可用于窩溝封閉[3]、抗菌[4]、牙本質(zhì)過(guò)敏[5]。蠶絲蛋白是一種天然的膠狀蛋白，由25%絲素蛋白(silk fibroin, SF)和75%絲膠組成，脫膠的SF具有低抗原性、可降解、良好的氧氣及水蒸氣滲透率[6]。有研究顯示，SF作為骨及皮膚的支架材料[7]，可加速引導(dǎo)骨組織再生(The guided bone regeneration, GBR)的愈合[8]，減少口腔黏膜缺損修復(fù)的傷口收縮[9]及支持細(xì)胞和毛細(xì)血管附著[10]。

BG和SF都是組織工程中理想的生物材料。本研究嘗試應(yīng)用組織工程學(xué)方法，將人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)接種于含不同濃度BG58S/SF復(fù)合膜上，探究其對(duì)hDPSCs生長(zhǎng)增殖及成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化的影響，為牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體的再生提供新思路和新方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、雙抗、胰蛋白酶-EDTA(Gibco，美國(guó))；I型膠原酶、Trizol(Sigma，美國(guó))；溴化鋰(LiBr)、無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)、AR(上海國(guó)藥)；無(wú)蛹蠶繭(江蘇兄弟藥業(yè))；透析袋(分子量3 500)(北京索萊寶)；CCK-8試劑盒、BCA試劑盒(上海貝博)；Hoechest33258(上海碧云天)；ALP試劑盒(南京建成)；SYBR Green PCR試劑盒(大連寶成)；羅明丹標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton，美國(guó))；熔融法制備的生物活性玻璃58S粉末[SiO2(60)-CaO(36)-P2O5(4)(wt%)](華南理工大學(xué)提供)；傅立葉紅外光譜儀(FTIR)(Nicoiet，美國(guó))；OCA15接觸角儀(Dataphysics，德國(guó))；CFX96 Real-Time PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 hDPSCs的分離和培養(yǎng)

取18～25歲因正畸減數(shù)拔除的健康、無(wú)齲、無(wú)牙周病的前磨牙(患者知情同意)，用含100 g/L雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗后，無(wú)菌條件下取出牙髓組織；在含800 g/L DMEM、200 g/L FBS雙抗、1 g/L雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液中剪碎后，用3 mg/mL Ⅰ型膠原酶消化離心后收集沉淀并接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱；3～4 d 換液1次，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶、2 g/L EDTA混合液消化傳代，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；通過(guò)流式細(xì)胞儀結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1分選并獲得hDPSCs[11]。

1.3 SF膜及BG58/SF膜的制備

取天然無(wú)蛹蠶繭60 g，在0.2 wt%的Na2CO3溶液中煮沸脫膠20 min，重復(fù)3次，脫膠后的蠶繭于60 ℃充分干燥；稱(chēng)取41.3 g LiBr并溶于50 mL去離子水中，同時(shí)取上述烘干的蠶繭5 g溶于其中，60 ℃水浴過(guò)夜，使蠶繭充分溶解，經(jīng)透析、離心后制得SF膠狀液體，4 ℃保存?zhèn)溆肹12]。

將BG58S粉末于180 ℃下干熱滅菌，分別按1、 5 mg/mL的終濃度加入到SF液中混合均勻；然后在24孔板的每個(gè)孔中分別滴加BG58S/SF懸濁液及純SF液各200 μL，使其浸潤(rùn)整個(gè)孔底，紫外線消毒，自然風(fēng)干；分別用傅立葉紅外光譜儀(FTIR)、OCA15接觸角儀檢測(cè)膜材料的特性。

1.4 hDPSCs接種和實(shí)驗(yàn)分組

取第3代hDPSCs制備成單細(xì)胞懸液，混合均勻后, 以2×104/孔的密度接種于24孔板內(nèi)的膜材料上, 分為A、B、C組：A組為純SF膜組；B組為1 mg/mL BG58S/SF膜組；C組為5 mg/mL BG58S/SF膜組；空白對(duì)照組為無(wú)材料膜的孔板。

1.5 hDPSCs增殖與形態(tài)觀察

分別于hDPSCs培養(yǎng)的第4、7、11、14天，用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度值；7、11 d時(shí)，用掃描電鏡和Hoechest33258及羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽熒光染色后，于正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 ALP活性檢測(cè)

取第3代hDPSCs，以2×104/孔的密度接種于24孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)7、14、21 d 時(shí)棄培養(yǎng)液，PBS清洗2～3次后；每孔加入10 g/L TritonX-100裂解細(xì)胞，使用ALP試劑盒進(jìn)行活性檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞的ALP活性(以金氏單位表示)。

1.7 RT-PCR引物序列

hDPSCs分別于培養(yǎng)7、14、21 d后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所有細(xì)胞用Trizol裂解，提取總RNA；用 1 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為PCR模板，細(xì)胞牙源性分化及礦化檢測(cè)分別用牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP-1)、牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、骨涎蛋白(BSP)，管家基因GAPDH作為內(nèi)參；人特異性引物序列根據(jù)Genebank發(fā)布的基因序列設(shè)計(jì)(表1)；RT-PCR使用SYBR Green PCR試劑盒，采用2-△△ct值對(duì)熒光定量結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 RT-PCR 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 材料特性分析

2.1.1 FTIR分析

BG58S/SF膜在1 420 cm附近出現(xiàn)弱峰尖，樣品在1 200～1 400 cm處出現(xiàn)光譜條帶(圖1)，圖中虛線示特征吸收峰。

2.1.2 接觸角分析

A、B、C組的接觸角(θ)分別為89.5°、55.2°、46.8°，其中A組接近臨界值(θ≈90°)，提示SF膜是耐水性很好的固載材料。隨著B(niǎo)G的加入，材料的親水性增加，且C組的接觸角小于B組。本結(jié)果顯示，C組的親水性更加優(yōu)良。

圖1 BG58S/SF膜在培養(yǎng)液中浸泡7 d后的FTIR圖譜

2.2 hDPSCs的增殖結(jié)果

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，4 d時(shí)，B、C組hDPSCs的增殖水平低于A組和對(duì)照組(P<0.05)，且A組與對(duì)照組細(xì)胞增殖水平無(wú)顯著差異(P>0.05)；7 d時(shí)，B、C組細(xì)胞增殖加快，但均低于對(duì)照組和A組(P<0.05)，且B、C組增殖無(wú)顯著差異(P>0.05)； 11、14 d時(shí)，C組增殖水平高于B組(P<0.05)(圖2)。

*與對(duì)照組相比P<0.05；#與B組相比P<0.05

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

2.3.1 SEM觀察細(xì)胞在膜材料上的生長(zhǎng)增殖狀況

SEM觀察結(jié)果顯示，各組hDPSCs均增殖良好，A、B、C組hDPSCs很好的粘附于材料表面。其中A呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞飽滿表面光滑；B、C組細(xì)胞表面粗糙，均有BG顆粒分布，且C組細(xì)胞層較B組更厚; B組細(xì)胞密集呈疊瓦狀，C組可見(jiàn)hDPSCs伸出偽足粘附在BG顆粒表面(圖3)。

2.3.2 正置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架

細(xì)胞骨架熒光染色可見(jiàn)，肌動(dòng)蛋白(微絲)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色；紅色的微絲呈長(zhǎng)梭形層疊交錯(cuò)分布在材料表面，藍(lán)色的細(xì)胞核被微絲包繞，所有肌動(dòng)蛋白骨架舒展并覆蓋在膜材料基質(zhì)表面；結(jié)果顯示，生物膜材料具有良好的生物相容性(圖4)。

2.4 ALP活性測(cè)定

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各實(shí)驗(yàn)組的ALP活性均呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的ALP活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且B、C組高于A組(P<0.05)。組間比較，第7天時(shí)，B組ALP活性顯著高于C組(P<0.05)；第14天時(shí)，B、C兩組無(wú)顯著差異(P>0.05)；第21天時(shí)，C組ALP活性高于B組(P<0.05)(圖5)。

圖3 各組hDPSCs培養(yǎng)7、11 d時(shí)細(xì)胞形態(tài)觀察(SEM，×1 000)

圖4 各組hDPSCs培養(yǎng)7、14 d時(shí)細(xì)胞骨架形態(tài)(正置熒光顯微鏡, ×10)

*與對(duì)照組相比P<0.05; #與B組相比P<0.05

2.5 膜材料對(duì)hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞樣分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞樣分化相關(guān)基因DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP在培養(yǎng)第7天檢測(cè)到其mRNA的表達(dá)。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的mRNA表達(dá)均上調(diào)并顯著且高于對(duì)照組(P<0.05)。組間比較顯示，B、C組細(xì)胞的mRNA表達(dá)上調(diào)且顯著高于A組(P<0.05)；B、C組細(xì)胞的mRNA表達(dá)上調(diào)因BG58S濃度的不同也存在明顯差異(P<0.05); 第14天時(shí)，DMP-1、DSP、BSP的表達(dá)水平C組較B組高(P<0.05)(圖6)。

*同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比P<0.05；#同時(shí)間點(diǎn)與B組相比P<0.05

3 討論

組織工程三要素是種子細(xì)胞、生物支架和生長(zhǎng)因子微環(huán)境；基本策略是通過(guò)支架材料向靶位點(diǎn)輸送種子細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖，分化形成靶組織。隨著組織工程研究的不斷深入，越來(lái)越關(guān)注支架材料的生物學(xué)性能，包括材料本身的生物學(xué)形態(tài)及與相鄰軟硬組織的關(guān)系和相互作用。評(píng)判一種材料的生物相容性已不是唯一指標(biāo)，具有生物活性的誘導(dǎo)基質(zhì)，并能在各階段對(duì)細(xì)胞行為進(jìn)行調(diào)控成為更理想的需求。

SF是一種天然的膠狀蛋白，含有18種氨基酸，其中80%是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸，比例為3 ∶2 ∶1。氨基酸的組成與人皮膚和毛發(fā)的角質(zhì)蛋白相似[13]，因此SF具有低抗原性和移植排斥反應(yīng)，多孔結(jié)構(gòu)有利于氧氣、水蒸氣及細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物的交換。SF已通過(guò)美國(guó)食品和藥物管理局的批準(zhǔn)[14]，經(jīng)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)等測(cè)試，其都能滿足組織工程的需要[15]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SF是一種臨界材料(θ≈90°)，推測(cè)SF在液體條件下具有降解性，但可能需要經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間。SF具有良好的生物相容性，能支持內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的附著及增殖[9]。本實(shí)驗(yàn)將hDPSCs接種于純SF膜上后生長(zhǎng)增殖良好，在第4天時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)期；但由于其為生物惰性材料，用純SF膜修復(fù)骨缺損在相同時(shí)間周期內(nèi)，其成骨樣組織量顯著低于羥磷灰石[16]，提示純SF促進(jìn)細(xì)胞功能性分化的能力有限。

上世紀(jì)70年代, Hench發(fā)現(xiàn)了一定成分組成的玻璃在體內(nèi)能與骨組織形成緊密的骨結(jié)合，并且這種玻璃對(duì)人體無(wú)不良反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，Hench研發(fā)出SiO2(46.1)-Na2O(24.4)-CaO(26.9)-P2O5(2.6)(wt%)四元組份的BG[17]。二十世紀(jì)九十年代新興了一種材料制備技術(shù)——溶膠-凝膠法，它被應(yīng)用于BG的制備，用此方法，Hench又研發(fā)出SiO2(60)-CaO(36)-P2O5(4)(wt%)的BG，稱(chēng)為58S。58S的典型結(jié)構(gòu)是介孔大小(孔徑在2～50 nm)，比表面積較熔融法制備的BG更大(150 m2/g)[18]，這種結(jié)構(gòu)使得58S具有更快的離子交換率；因?yàn)?8S具有高CaO/P2O5比率，當(dāng)58S暴露于溶液介質(zhì)中可形成高濃度的SiO2，從而使58S表面更快形成羥基磷灰石層且提高其生物活性[19-21]。Christodoulou等[22]研究表明，58S會(huì)顯著上調(diào)RunX2、cbfa1、AP、OPN、BSP、OC等成骨相關(guān)基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答，為BG用于組織工程提供了分子水平上的理論依據(jù)；既可溶性的Si4+、Ca2+等離子增加了細(xì)胞增殖，上游轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、信號(hào)蛋白同時(shí)調(diào)控了骨樣細(xì)胞分化。BG萃取液的缺點(diǎn)是在體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞會(huì)瞬時(shí)接觸高濃度的離子產(chǎn)物，而無(wú)法隨時(shí)間累積以逐漸適應(yīng)離子濃度的遞增[18]。由于BG的脆性大、彎曲強(qiáng)度低，其在生理環(huán)境中的抗疲勞及抗破壞強(qiáng)度不高；而高分子材料則具有較好的塑性和抗張能力，因此，將生物玻璃與高分子材料復(fù)合可有望提高支架材料整體的力學(xué)性能，并在一定程度上能控制其離子產(chǎn)物緩慢釋放。

FTIR分析結(jié)果顯示，BG58S/SF膜在1 420 cm附近出現(xiàn)弱峰尖，說(shuō)明礦化過(guò)程中部分CO32-基團(tuán)取代了磷灰石中的PO43-基團(tuán)，可認(rèn)為復(fù)合材料表面的磷灰石為磷酸羥基磷灰石；SF在1 200～1 400 cm光譜帶內(nèi)具有其他蛋白質(zhì)而沒(méi)有的紅外光譜特征；樣品在1 655 cm處出現(xiàn)酰胺I帶的C=O伸縮振動(dòng)峰，表明SF的三股螺旋結(jié)構(gòu)存在，提示其適合做生物醫(yī)用材料[23]。人體中水的含量大約為65%，大部分化學(xué)反應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸都離不開(kāi)水環(huán)境，且細(xì)胞較易在親水的表面粘附和生長(zhǎng)[24]。若接觸角(θ)<90°則固體表面具有親水性；θ>90°則固體表面具有疏水性; θ≈90°為臨界值。本實(shí)驗(yàn)接觸角分析顯示，SF膜的表面接觸角接近臨界值，提示SF是耐水性很好的固載材料，隨著B(niǎo)G的加入，材料的親水性增加，更利于細(xì)胞在材料表面的粘附。另一方面，親水性對(duì)材料的降解有決定性作用，同時(shí)也影響到其機(jī)械性能。FTIR和接觸角分析顯示，BG58S/SF膜是一種理想的生物膜材料。本實(shí)驗(yàn)將hDPSCs接種到材料膜上，SEM和細(xì)胞骨架熒光染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的hDPSCs均呈長(zhǎng)梭形交織層疊生長(zhǎng)，細(xì)胞觸角粘附在材料表面；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，hDPSCs接種于BG58S/SF膜的前4 d無(wú)顯著增長(zhǎng)，第7天后，B、C兩組細(xì)胞增殖達(dá)到對(duì)數(shù)期，與之前體外實(shí)驗(yàn)BG在組織培養(yǎng)液中釋放出高濃度的Ca2+，3 d后Ca2+的釋放趨于穩(wěn)定，含適宜濃度無(wú)機(jī)離子培養(yǎng)液的微環(huán)境對(duì)細(xì)胞更有利[25]的研究結(jié)果相符。11、14 d時(shí)， C組細(xì)胞的增殖能力顯著高于B組，提示5 mg/mL BG58S/SF膜促進(jìn)了細(xì)胞的有絲分裂以維持hDPSCs處于生長(zhǎng)周期且優(yōu)于1 mg/mL BG58S/SF膜，其釋放動(dòng)力學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

將hDPSCs分別接種于各組，在第7、14、21天檢測(cè)DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP基因的表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，7 d時(shí)，B、C組細(xì)胞DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP的表達(dá)顯著上調(diào)，提示BG58S/SF膜促進(jìn)了hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化且具有礦化潛能。組間比較發(fā)現(xiàn)，C組細(xì)胞的基因表達(dá)上調(diào)較B組更為顯著，推測(cè)58S所釋放出的離子濃度對(duì)hDPSCs的分化產(chǎn)生了重要影響。在成骨細(xì)胞中同樣觀測(cè)到了類(lèi)似的離子濃度依懶性，當(dāng)Si4+濃度在15～20 μg/mL時(shí)可促進(jìn)成骨細(xì)胞新陳代謝達(dá)到峰值，并同時(shí)促進(jìn)cbfa1的表達(dá)，增強(qiáng)礦化結(jié)節(jié)的形成; 還發(fā)現(xiàn)低(2～4 mmol)、中(6～8 mmol)濃度的Ca2+適于成骨細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)礦化[26-27]。組織再生需要大量自體細(xì)胞或外源性細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期經(jīng)歷分化形成靶組織，且需要將細(xì)胞毒性刺激降到最低或避免細(xì)胞過(guò)早進(jìn)入凋亡期[18]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7 d時(shí)，B、C兩組細(xì)胞增殖顯著增快；11 d時(shí)，C組細(xì)胞增殖水平高于B組，表明5 mg/mL BG58S/SF膜溶解后的離子濃度使hDPSCs無(wú)論是數(shù)量上或時(shí)間上在其增殖與凋亡之間均獲得了適當(dāng)?shù)钠胶?，而這種平衡有利于Si4+、Ca2+、P5+等調(diào)控hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化和細(xì)胞間基質(zhì)礦化基因的表達(dá)。hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞樣分化相關(guān)基因DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP表達(dá)結(jié)果顯示，5 mg/mL BG58S/SF膜各相關(guān)基因表達(dá)水平均高于1 mg/mL BG58S/SF膜，該結(jié)果與5 mg/mL 58S/SF膜維持了更多的細(xì)胞處于細(xì)胞周期相一致。

本結(jié)果表明，5 mg/mL BG58S/SF對(duì)hDPSCs增殖和分化作用更為理想，是一種具有促進(jìn)牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體再生潛能的組織工程膜材料，為牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體再生提供了新的思路和方法。

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Bioactive glass 58S/silk fibroin membrane premotes proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells

LYU Xiao-shuai, LI Zheng-mao, YANG Xue-chao

(KeyLaboratoryofOralMedicine,GuangzhouInstituteofOralDisease,StomatologyHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510140,China)

AIM: To investigate the effect of bioactive glass 58S/silk fibroin (BG58S/SF) membrane on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs). METHODS:hDPSCs were seeded on pure SF membrane and BG58S/SF with BG58S at 1 mg/mL and 5 mg/mL respectively after the materials were incubated in cell culture medium for 24 hours. Cell proliferation was assessed by CCK-8 kit after 4, 7, 14 and 21 d culture respectively. The adhesion of hDPSCs on the material surface was evaluated by SEM and cytoskeleton staining; ALP activity was measured by ALP kit and the expression of odontoblastic differentiation-related genes was measured by RT-PCR. One-way ANOVA and paired test were used for statistical analysis . RESULTS： hDPSCs proliferated well on the surface of the membranes throughout the culture period. ALP activity was enhanced in all the 3 groups from day 7, BG58S/SF membrane groups showed higher ALP activity than SF group (P<0.05). BG58S/SF groups showed higher up-regulation of odontoblastic differentiation-associated genes than to SF group (P<0.05). ALP activity and orodontoblastic differentiation-associated gene expression level in 5 mg/mL BG58S/SF group was higher than that in 1 mg/mL group (P<0.05). CONCLUSION: BG58S/SF membrane may promote the proliferation and odontoblastic differentiation of hDPSCs.

bioactive glass; human dental pulp stem cells; silk fibroin; tissue engineering

2015-05-29;

2015-08-18

廣東省教育廳特色創(chuàng)新項(xiàng)目(2014TSCX103)

呂孝帥(1988-)，女，漢族，湖北武漢人。碩士生(導(dǎo)師：楊雪超)

楊雪超，E-mail: xyang.gmu@gmail.com

R780.2

A

1005-2593(2015)10-0577-07

廣州省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013-53)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2014328)

廣東省2015高等教育“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”專(zhuān)項(xiàng)資金(B1531033)