牛福華，張安紅，常立群，徐慶陽(yáng)

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750100；3.寧夏農(nóng)業(yè)勘查設(shè)計(jì)院，寧夏銀川750000）

不同預(yù)處理方式的玉米漿應(yīng)用于L-蘇氨酸發(fā)酵的研究

牛福華1，張安紅2，常立群3，徐慶陽(yáng)1

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750100；3.寧夏農(nóng)業(yè)勘查設(shè)計(jì)院，寧夏銀川750000）

通過(guò)對(duì)玉米漿進(jìn)行不同工藝的預(yù)處理，獲得酸化玉米漿、酸水解玉米漿和酶水解玉米漿。通過(guò)全氨基酸分析和不同比例配比的L-蘇氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，獲得了菌體生長(zhǎng)好、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸水平較高的優(yōu)化組合。最佳玉米漿配比為玉米原漿和酸水解玉米漿2∶1，發(fā)酵周期縮短為36 h，產(chǎn)酸率提高至135 g/L。

L-蘇氨酸；發(fā)酵；酶水解玉米漿；酸水解玉米漿

玉米漿是玉米淀粉制備過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，是用亞硫酸浸泡玉米的水經(jīng)過(guò)濃縮加工制成的，為黃褐色的濃稠不透明的絮狀懸浮物，其中固體含量在50%左右，由于玉米漿含有豐富的氨基酸、還原糖、磷、磷、微量元素和生長(zhǎng)素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［1］，且制備成本低廉，多年來(lái)在發(fā)酵行業(yè)有著極為廣泛的應(yīng)用。

玉米漿中大部分氨基酸以大分子蛋白形式存在，微生物對(duì)其利用較為困難，為了向發(fā)酵生產(chǎn)提供足夠有效的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，往往需要添加較大比例的玉米漿，由于大分子蛋白以及其他膠體類雜質(zhì)是發(fā)酵過(guò)程泡沫產(chǎn)生的主要原因之一，隨著玉米漿用量加大，發(fā)酵罐利用效率隨之降低。另外玉米漿中不溶性顆粒及部分不易高溫殺滅的微生物芽孢隨之增多，發(fā)酵染菌風(fēng)險(xiǎn)增大。在部分玉米漿用量較高的發(fā)酵領(lǐng)域中，不僅發(fā)酵過(guò)程會(huì)受到影響，而且玉米漿中大量未被利用的雜質(zhì)隨發(fā)酵液進(jìn)入提取環(huán)節(jié)，同樣對(duì)提取過(guò)程產(chǎn)生各種不利影響，如除雜難度加大、主產(chǎn)品收率降低等等，這些雜質(zhì)最后進(jìn)入廢液，往往成為廢液處理困難的部分因素［2］。

為解決這些問(wèn)題，對(duì)含豐富有機(jī)氮源的原料進(jìn)行預(yù)處理已成為近年來(lái)研究較多的一個(gè)領(lǐng)域，目前豆粕水解液，菌體蛋白水解工藝及發(fā)酵應(yīng)用均有研究報(bào)道［3-6］，與未水解原料相比，微生物對(duì)有機(jī)氮源利用效率較高，可明顯提高發(fā)酵產(chǎn)量，但這些原料大多價(jià)格昂貴，不利于發(fā)酵成本的控制。本文以廉價(jià)易得的玉米漿為原料，分別比較酸化、酸水解和酶水解的方式預(yù)處理玉米漿的優(yōu)劣性，同時(shí)將所得玉米漿以不同組合配比應(yīng)用于L-蘇氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以期獲得更易為微生物利用，成本低廉的玉米漿預(yù)處理方式。

1　材料與方法

1.1菌種和培養(yǎng)基

1.1.1菌種

L-蘇氨酸菌種為天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌種。

1.1.2斜面培養(yǎng)基

酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖2 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，磷酸氫二鉀3.5 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，0.12 MPa，120℃滅菌20 min，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h備用。

1.1.3種子肉湯培養(yǎng)基

酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0～7.2，0.12 MPa，120℃滅菌20 min后備用。1.1.4種子培養(yǎng)基

葡萄糖40 g/L，硫酸銨4 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，玉米漿10 g/L，酵母粉2 g/L，水1 000 mL，pH 7.0，120℃條件下滅菌20 min，冷卻后備用。

1.1.5發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖40 g/L，糖蜜10 g/L，玉米漿10 g/L，硫酸銨7 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.9 g/L，硫酸亞鐵0.5 g/L，硫酸錳0.5 g/L，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，120℃滅菌20 min。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

立式壓力蒸汽滅菌器，5 L搪瓷反應(yīng)釜，5 L不銹鋼機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，10 L不銹鋼機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，實(shí)驗(yàn)室小型板框壓濾機(jī)，德國(guó)安米諾西斯公司A300氨基酸分析儀。

1.3實(shí)驗(yàn)材料

玉米漿（總氮3%～4%），98%工業(yè)硫酸，復(fù)合蛋白酶。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1酸水解玉米漿工藝

取1 L玉米漿加入5 L搪瓷反應(yīng)釜中，開(kāi)啟攪拌，按水料比1∶2，硫酸終濃度15%，加入自來(lái)水、工業(yè)硫酸，混合均勻后關(guān)閉加料口，通過(guò)夾套蒸氣加熱使系統(tǒng)升至110℃，維持水解溫度15 h后，降溫至60℃以下放料，經(jīng)板框過(guò)濾后取濾液即為玉米漿酸水解液。

1.4.2酸化玉米漿工藝

取1 L玉米漿加入5 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，通氨使pH達(dá)到7.0～8.0后，用板框壓濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，當(dāng)濾嘴流出料液與正常流量相比明顯減小時(shí)，停止過(guò)濾。將上清濾液中加濃硫酸調(diào)pH至3.0～3.5，即得酸化玉米漿。

1.4.3酶水解玉米漿工藝

取玉米漿1 L加入5 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，按水料比1∶1加入自來(lái)水，通氨調(diào)pH至7.00± 0.05，升溫至65℃，加入反應(yīng)體積1%的復(fù)合蛋白酶，攪拌速度為200 r/min，反應(yīng)8 h后，升溫至90℃，維持15 min滅酶，然后冷卻至室溫，即得酶水解玉米漿。

1.5發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.5.1斜面活化培養(yǎng)

取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，37℃培養(yǎng)20～24 h。

1.5.2種子培養(yǎng)

從生長(zhǎng)良好的活化斜面刮一滿環(huán)菌苔，接入裝有25 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9層紗布封口，置于巡回式搖床（220 r/min）上，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期［7］。

1.5.35 L罐種子培養(yǎng)

用無(wú)菌水沖洗生長(zhǎng)良好的活化斜面2支，用玻璃刮刀全部刮下后倒入滅菌的三角瓶中，以火焰接種方式接入5 L自動(dòng)控制種子罐中，5 L種子罐中裝液量2 L，溫度控制在37℃，自動(dòng)流加氨水控制pH至7.0，通風(fēng)量200 L/h，初始攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，通過(guò)流加泡敵消泡，種子培養(yǎng)14 h。

1.5.410L罐發(fā)酵

5L種子罐種子以3%接種量（300 mL），火焰接種方式接入10 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，10 L發(fā)酵罐中裝液量為6 L，溫度控制在37℃，自動(dòng)流加氨水控制pH至7.0，通風(fēng)量200 L/h，初始攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，通過(guò)流加泡敵消泡，發(fā)酵40 h。

1.6檢測(cè)方法

1.6.1總氮測(cè)定

采用凱式定氮法。

1.6.2游離銨氮（銨氮）測(cè)定

采用凱式定氮法，在總氮檢測(cè)基礎(chǔ)上省去消解過(guò)程。

1.6.3全氨基酸分析

按照德國(guó)安米諾西斯公司A300氨基酸分析儀自帶的上樣分析程序進(jìn)行。

1.6.4發(fā)酵液L-蘇氨酸含量測(cè)定

采用2，4-二硝基氟苯柱前衍生HPLC法測(cè)定。色譜分離條件：色譜柱為美國(guó)安捷倫ZORBOX Eclipse AAA，Analytical 4.6×150 mm 5 μm，柱溫33℃，檢驗(yàn)波長(zhǎng)360 nm，流動(dòng)相總流量1 mL/ min。

1.6.5菌體濃度測(cè)量方法

吸取樣品菌液0.2 mL至5 mL蒸餾水中，搖勻后用722分光光度計(jì)在波長(zhǎng)562 nm下測(cè)定OD值。

2　結(jié)果與討論

2.1不同預(yù)處理方式的玉米漿全氨基酸分析

將同一批次的玉米漿以及經(jīng)酸水解、酸化和酶水解處理的玉米漿分別通過(guò)氨基酸分析儀進(jìn)行全氨基分析，分析結(jié)果如表1所示。

從表1氨基酸分析結(jié)果可以看出，從氨基酸總量來(lái)看，酸化玉米漿經(jīng)過(guò)先通氨調(diào)節(jié)pH至7.0～8.0，再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾的方式除去蛋白沉淀，總氨基酸量減少。在處理過(guò)程中玉米漿中的固形物在pH中性附近明顯增加，說(shuō)明蛋白質(zhì)達(dá)到了等電點(diǎn)。該處理方式雖然簡(jiǎn)單快捷，易于在生產(chǎn)上推廣，而且使得發(fā)酵配料以及消毒滅菌過(guò)程更容易進(jìn)行，但是酸化玉米漿中總氨基酸量減少，從而在生產(chǎn)上需要使用更多的量來(lái)補(bǔ)充。與玉米原漿相比其他方式處理的玉米漿總氨基酸變化不大。

表1　每100 mL不同預(yù)處理玉米漿全氨基酸分析數(shù)據(jù)g/mL

從單氨基酸變化來(lái)看，酸化玉米漿由于總蛋白量的減少，導(dǎo)致所有單氨基酸量也少于玉米原漿。而酶解玉米漿和酸水解玉米漿由于通過(guò)生物或化學(xué)的手段使玉米原漿中的蛋白發(fā)生了水解，從而增加了單氨基酸的含量。特別是天冬氨酸（Asp）的量幾乎增加了一倍。而由于天冬氨酸是蘇氨酸發(fā)酵的前體物，因此玉米漿的酶解或酸解可能會(huì)對(duì)蘇氨酸的發(fā)酵產(chǎn)生一定影響。

2.2不同預(yù)處理方式的玉米漿發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)基配比除玉米漿外，其他成分按照原蘇氨酸生產(chǎn)配方配制，玉米原漿、酸解玉米漿、酸化玉米漿和酶解玉米漿分別按照相同的總氮折算添加量，通過(guò)10 L發(fā)酵罐進(jìn)行L-蘇氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分別比較不同預(yù)處理方式的玉米漿對(duì)L-蘇氨酸發(fā)酵過(guò)程中菌體量（OD）和L-蘇氨酸產(chǎn)酸的影響，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2　不同玉米漿對(duì)L-蘇氨酸菌體生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，不同玉米漿對(duì)蘇氨酸菌體生長(zhǎng)影響不同，其中使用玉米原漿的批次菌體生長(zhǎng)緩慢，在發(fā)酵24 h左右菌體量才達(dá)到最大值，而且后期菌體量維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；其他三種玉米漿的批次菌體生長(zhǎng)較快，在發(fā)酵15 h左右均達(dá)到菌體量的最大值，但是后期菌體量逐漸下降，尤其是使用酸化玉米漿的批次，最終的菌體OD降至發(fā)酵12 h左右的水平。

造成以上結(jié)果的原因是由于玉米原漿未經(jīng)過(guò)水解處理，其所含氮源主要以蛋白質(zhì)形式存在，必須在發(fā)酵過(guò)程中被微生物分泌的蛋白酶逐漸水解成氨基酸，才能被菌體吸收和進(jìn)一步分解代謝，最終用于合成菌體細(xì)胞物質(zhì)和L-蘇氨酸。因此利用玉米原漿發(fā)酵菌體生長(zhǎng)速度慢，但是培養(yǎng)基中的氨基酸是隨著菌體的生長(zhǎng)被逐步分解利用的，從而保證了菌體量后期比較平穩(wěn)。而酸化玉米漿在制備過(guò)程中過(guò)濾掉大部分蛋白固形物，所含氨基酸量最少，所以雖然前期菌體容易利用游離氨基酸快速生長(zhǎng)，但到后期隨著培養(yǎng)基中氨基酸消耗殆盡，菌體營(yíng)養(yǎng)缺乏從而使得菌體量逐步下降。對(duì)于酸解玉米漿和酶解玉米漿的菌體生長(zhǎng)情況則介于以上兩者之間。

圖3　不同預(yù)處理玉米漿對(duì)L-蘇氨酸產(chǎn)酸的影響

由圖3可知，使用玉米原漿的發(fā)酵批次前期L-蘇氨酸產(chǎn)酸水平低于使用水解或酸化玉米漿的批次，但是發(fā)酵39 h最終產(chǎn)酸水平達(dá)到最高的130 g/L。而使用酸化玉米漿發(fā)酵批次前期產(chǎn)酸較快，在發(fā)酵27 h基本達(dá)到最高產(chǎn)酸水平120 g/L，但是后期L-蘇氨酸含量逐步下降。結(jié)合圖2進(jìn)行分析，由于氨基酸發(fā)酵屬于與菌體生長(zhǎng)部分偶聯(lián)的發(fā)酵類型，菌體量的高低一定程度上決定產(chǎn)酸水平的高低。使用玉米原漿的發(fā)酵批次中菌體量隨著有機(jī)氮源逐步分解利用而緩慢增長(zhǎng)，從而決定了L-蘇氨酸產(chǎn)酸水平伴隨菌體量的增加而緩慢增加，最終達(dá)到了最大值。而酸化玉米漿前期菌體容易利用游離氨基酸快速增長(zhǎng)，但到后期隨著培養(yǎng)基中氨基酸消耗殆盡，菌體營(yíng)養(yǎng)缺乏從而OD下降，甚至可能消耗已經(jīng)合成的L-蘇氨酸，從而使產(chǎn)酸水平偏低。酸解玉米漿和酶解玉米漿基本上符合先快后慢的產(chǎn)酸速度，L-蘇氨酸的產(chǎn)量變化介于玉米原漿和酸化玉米漿之間，符合以上分析的原因。

2.3不同預(yù)處理的玉米漿組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

從2.2不同處理玉米漿發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，在L-蘇氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中使用玉米原漿雖然菌體量和產(chǎn)酸率最高，但是發(fā)酵培養(yǎng)基配料和滅菌過(guò)程存在風(fēng)險(xiǎn)，而且發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)慢，產(chǎn)酸速度慢，從而延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，增加了發(fā)酵成本；使用酸化玉米漿雖然制備過(guò)程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)上較易推廣，有利于發(fā)酵培養(yǎng)基配料和消毒，但是發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)不足，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸水平都受到了影響；使用酸解玉米漿和酶解玉米漿也存在發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸先快后慢，先升后降的問(wèn)題，而且酸解玉米漿制備過(guò)程對(duì)設(shè)備腐蝕性大，現(xiàn)場(chǎng)操作環(huán)境差。酶解玉米漿則需要添加復(fù)合蛋白酶，成本較高。

綜合考慮以上原因，我們考慮將玉米原漿和酸解玉米漿混合配料使用，使得菌體在發(fā)酵前期可以充分利用酸解玉米漿的游離氨基酸進(jìn)行快速生長(zhǎng)，在發(fā)酵后期菌體量達(dá)到一定水平之后可以快速分解玉米原漿中的蛋白繼續(xù)合成蘇氨酸，從而達(dá)到既縮短發(fā)酵周期又提高發(fā)酵產(chǎn)酸的目的。

根據(jù)以上分析，我們首先排除掉酸化玉米漿不再進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。在保持總氮一定的條件下，將玉米原漿和酸解玉米漿分別按照1∶1和2∶1的比例進(jìn)行L-蘇氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4　玉米漿原漿和酸解玉米漿1∶1發(fā)酵過(guò)程曲線

圖5　玉米漿原漿和酸解玉米漿2∶1發(fā)酵過(guò)程曲線

從圖4和圖5可知，將玉米原漿和酸解玉米漿分別按照1∶1或2∶1的比例配比進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，菌體OD和L-蘇氨酸產(chǎn)酸水平均優(yōu)于單一使用玉米原漿或酸解玉米漿的發(fā)酵批次。這是由于二者的混合使用既滿足了菌體前期生長(zhǎng)對(duì)游離氨基酸的快速使用需求，又存在足夠的有機(jī)氮源為菌體后期合成蘇氨酸提供了原料，從而產(chǎn)生了較為理想的結(jié)果。玉米原漿和酸解玉米漿混合配料的使用，使發(fā)酵周期縮短至36 h內(nèi)，L-蘇氨酸發(fā)酵過(guò)程使用玉米原漿和酸解玉米漿2∶1的比例最高產(chǎn)酸達(dá)到135 g/L，21 h最高OD值達(dá)到46.75，而使用玉米原漿和酸解玉米漿1∶1的比例最高產(chǎn)酸達(dá)到126 g/L，18 h最高OD值為45.25。從成本及發(fā)酵指標(biāo)考慮，選擇玉米原漿和酸解玉米漿2∶1的比例作為最佳發(fā)酵配比。

3　討論

影響L-蘇氨酸產(chǎn)量的因素有很多，如菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等。其中氮源種類的選擇及其用量對(duì)菌體生長(zhǎng)和L-蘇氨酸的產(chǎn)量影響非常大［8］。Kazuk IOkamto等［9］報(bào)道有機(jī)氮源中含有菌體生長(zhǎng)必需的生長(zhǎng)因子和微量元素，用量不當(dāng)會(huì)引起L-蘇氨酸產(chǎn)量20%～30%的波動(dòng)。本研究選擇廉價(jià)易得的玉米漿作為有機(jī)氮源，并通過(guò)用不同的方式進(jìn)行預(yù)處理，獲得了適合L-蘇氨酸發(fā)酵使用的最佳玉米漿配比，提高了L-蘇氨酸的產(chǎn)率。使用酸水解或酶水解預(yù)處理玉米原漿，將其中的蛋白質(zhì)分子降解為多肽及游離氨基酸，除了具有使菌體更容易利用，提高了L-蘇氨酸產(chǎn)率的好處外，可能還具有節(jié)省消泡劑的用量，降低成本；增加溶氧促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高產(chǎn)酸率；營(yíng)養(yǎng)容易利用，提高產(chǎn)酸轉(zhuǎn)化率，縮短發(fā)酵周期；增加發(fā)酵罐裝液量，提高單產(chǎn)；釋放更多可利用有機(jī)氮源，減少無(wú)機(jī)氮（液氨）使用量等優(yōu)點(diǎn)，需要在以后的生產(chǎn)和科研實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］徐慶陽(yáng)，孫家凱，吳曉嬌.有機(jī)氮源對(duì)谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-纈氨酸的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（5）：12-16.

［2］劉康樂(lè)，劉秀敏，聶曉東.玉米漿水解工藝研究［J］.發(fā)酵科技通訊，2013，42（1）：26-28.

［3］白志川，方才君，劉正伏.硫酸水解豆粕制備復(fù)合氨基酸的正交試驗(yàn)［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（6）：774-776.

［4］劉利鋒，于海燕，馬建.菌體蛋白水解液代替豆粕水解液［J］.發(fā)酵科技通訊，2005，34（2）：10.

［5］姚菁華，肖雷.谷氨酸菌體蛋白的酶解試驗(yàn)研究［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，11（4）：52-55.

［6］劉利鋒.豆粕水解液對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響［J］.發(fā)酵科技通訊，2004，33（2）：6-7.

［7］孫玉華，馮志彬，徐慶陽(yáng)，等.基于穩(wěn)健性設(shè)計(jì)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵過(guò)程［J］.生物技術(shù)通訊，2007，18（1）：57-59.

［8］馮志彬，孫玉華，陳寧，等.碳源對(duì)L-蘇氨酸發(fā)酵的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（8）：15-17.

［9］OKAMOTO K，IKEDA M.Development of an industrially stable process for L-threonine fermentation by an L-methionineauxotrophic mutant of Escherichia coli［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，89（1）：87-89.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Study on different pretreatments of corn syrup used in L-threonine fermentation

NIU Fuhua1，ZHANG Anhong2，CHANG Liqun3，XU Qingyang1
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Ningxia EPPEN Biotech Co.，Ltd.，Yinchuan 750100，China；3.Ningxia Agricultural Institute of Survey and Design，Yinchuan 750000，China）

The acidulated corn syrup，acid-hydrolyzed corn syrup and enzymatic-hydrolyzed corn syrup were obtained through various pretreatments of corn syrup.The optimized proportion of pretreated corn syrup with good cell growth，short fermentation period and high L-threonine productivity was obtained by total amino acid analysis and L-threonine fermentation experiments. The optimum ratio of corn syrup and acid-hydrolyzed corn syrup was 2∶1.The fermentation period was shortened to 36 h，and the yield of L-threonine was increased to 135 g/L.

L-threonine；fermentation；enzymatic-hydrolyzed corn syrup；acid-hydrolyzed corn syrup

TQ922

A

1674-2214（2015）03-0018-05

2015-01-08

牛福華（1979—），女，寧夏銀川人，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)樯锕こ?，E-mail：335308938@qq.com.