吳 炯， 李 軍， 鄔升超， 張春燕， 宋斌斌， 王蓓麗， 郭 瑋， 潘柏申

(1.上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海200032;2.上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院心外科，上海200032)

華法林是臨床上防治靜脈和動脈血栓栓塞疾病廣泛使用的口服抗凝藥物，主要針對有房顫、心臟瓣膜置換、深靜脈血栓以及肺栓塞患者?；颊咄ㄟ^檢測血液國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)，以 INR 是否進(jìn)入 1.8～3.0的有效治療范圍來判斷華法林抗凝治療是否療效。華法林本身狹窄的治療窗以及個體代謝能力的差異導(dǎo)致抗凝不足或抗凝過量等問題一直無法得到很好的解決。

眾多研究表明基因及非基因因素(種族、年齡、體重、胺碘酮等)共同對患者所需華法林劑量產(chǎn)生影響。基因因素公認(rèn)與個體間華法林抗凝療效存在顯著相關(guān)性［1-5］，包括華法林體內(nèi)代謝與藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)基因(CYP2C9和VKORC1)以及維生素K1代謝循環(huán)中相關(guān)酶類的活性改變的相關(guān)基因(GGCX、EPHX1和 CYP4F2)［6-8］。我們通過選取不同的2組人群，研究包括 CYP2C9、VKORC1、GGCX、EPHX1、CYP4F2 在內(nèi)的5 個基因共9個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對華法林初始抗凝療效和維持劑量的影響，為臨床上更安全、有效地使用華法林提供依據(jù)。

材料和方法

一、對象

1.初始抗凝療效組 選取2012年10月至2013年3月在上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心臟外科病區(qū)進(jìn)行心臟瓣膜置換手術(shù)的漢族患者212例，其中男106例、女106例，年齡(53±13)歲。入組患者需滿足以下條件:18周歲以上、心臟瓣膜置換術(shù)后即開始服用華法林、基礎(chǔ)INR≤1.4、目標(biāo)INR在1.8～3.0之間。同時臨床醫(yī)生均在對患者基因型不知情的情況下進(jìn)行抗凝治療，首劑量為2.5～3.75 mg(2.5 mg/片，華法林鈉片)之間，之后根據(jù)INR的檢測結(jié)果進(jìn)行劑量調(diào)整。

2.維持劑量組 選取2012年10月至2013年3月在上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診的漢族患者266例，其中男146例、女120例，年齡(61±14)歲。入選患者中房顫78例、心臟瓣膜置換120例、肺栓塞36例、深靜脈血栓12例。所有患者均服用華法林3個月以上，通過調(diào)整達(dá)到穩(wěn)定服藥劑量(相隔7 d，2次INR檢測結(jié)果均在1.8～3.0之間)。

上述兩組患者均無既往肝腎疾病史，除胺碘酮外不服用其它會影響華法林藥效的藥物，如阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等。

二、方法

1.標(biāo)本和基本信息采集 (1)初始抗凝療效組:在患者完成心臟瓣膜置換手術(shù)后，采用乙二胺四乙酸二鉀(ethlene diamine tetraacetic acid-K2，EDTA-K2)抗凝管采集患者血液標(biāo)本，通過查閱電子病歷記錄患者術(shù)后4 d內(nèi)的基本信息，包括每日服用華法林劑量(mg)、每日INR檢測結(jié)果、是否使用胺碘酮，3 d引流總量(mL)等;(2)維持劑量組:入組患者按要求于門診隨訪時采用EDTA-K2抗凝管采集患者血液標(biāo)本，同時記錄近期INR檢查情況、達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后華法林劑量以及其它合并藥物的使用情況。將采集的血液樣本分裝后置于－20℃保存。

2.基因組DNA抽提 使用基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，按照試劑盒提供說明書操作，測定DNA含量。

3.基因分型 使用Primer Premier 5.0軟件針對 CYP2C9(rs1799853、rs1057910)、VKORC1(rs9923231)、CYP4F2(rs2108622)、GGCX(rs12714145)、EPHX1(rs1877724、rs2292566、rs4653436)基因位點(diǎn)設(shè)計引物，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成引物。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增體系:上下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L)、DNA 模板 4 μL(100～120 ng)、Premix TaqTMHot Start Version(TaKaRa)10 μL、去離子水5μL，反應(yīng)總體積20μL。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)后72℃再延伸2 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段長度驗證，見圖1。由華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，以Chromas軟件判讀基因型，見圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

表1 華法林相關(guān)基因引物序列表

圖2 測序法基因分型結(jié)果

4.觀察指標(biāo)的設(shè)定 患者服用華法林后的目標(biāo)INR范圍定義“有效治療范圍”(1.8～3)。(1)初始抗凝療效組:設(shè)定初始抗凝療效觀測期為4 d。我們認(rèn)為患者在以基本相同的經(jīng)驗性給藥方式下進(jìn)行抗凝治療，在觀測期結(jié)束時INR的結(jié)果與初始INR的差值可以反映初始抗凝的療效，因此我們將該差值以△INR4-1表示。同時還設(shè)定了其它觀測指標(biāo)，包括首日服藥后INR檢測結(jié)果與初始INR值的差，以△INR2-1表示;INR進(jìn)入治療窗的例數(shù);INR＞3的例數(shù);INR＞4的例數(shù);出血事件;(2)維持劑量組:將“達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)”定義為相隔7 d以上，在服用相同劑量華法林的情況下，2次INR檢測結(jié)果均在治療窗內(nèi)，則該劑量即為患者華法林維持劑量。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用卡方檢驗判斷各SNPs的等位基因頻率和基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)如維持劑量，使用自然對數(shù)進(jìn)行變換。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗驗證數(shù)據(jù)的正態(tài)性。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，如Ln(維持劑量)、體重、體表面積(body surface area，BSA)和年齡等以兩獨(dú)立樣本t檢驗比較兩組間的差異，以單因素方差分析比較多組間的差異。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，如△INR4-1，2組間比較采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗。連續(xù)變量之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、初始劑量組基本資料及初始抗凝療效

初始劑量組共入組212例心臟瓣膜置換患者基本資料見表2。根據(jù)△INR4-1的結(jié)果，將其進(jìn)行四分位分組后觀察影響因素?；蛞蛩刂蠧YP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)及EPHX1(rs2292566)對△INR4-1有明顯影響(P＜0.05)。CYP2C9(rs1057910)和 EPHX1(rs2292566)對三日內(nèi)INR是否進(jìn)入治療范圍有明顯影響(P＜0.001、P＜0.05)。見表3。

篩選得到的基因 CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和 EPHX1(rs2292566)進(jìn)一步分析顯示，CYP2C9(rs1057910)AC/CC型患者的△INR4-1［中位數(shù)(四分位間距)］為1.10(0.87～1.41)，明顯高于 AA 型患者［0.69(0.30～1.05)］(P＜0.05)。VKORC1(rs9923231)AA 型患者的△INR4-1為0.81(0.45～1.25)，明顯高于GA 型患者［0.31(0.12～0.75)］，P＜0.05。EPHX1(rs2292566)GA/AA型患者的△INR4-1為0.84(0.45～1.22)，明顯高于 GG 型患者［0.63(0.27～0.97)］(P＜0.05)。見表4。

根據(jù)CYP2C9(rs1057910)，VKORC1(rs9923231)和EPHX1(rs2292566)的基因型分組。結(jié)果顯示CYP2C9基因AC/CC型患者服藥3 d后INR進(jìn)入治療范圍(1.8～3.0)的例數(shù)明顯高于CYP2C9基因AA型(P＜0.05)，且并不受VKORC1基因型的影響。CYP2C9基因AA型和VKORC1基因AA型、EPHX1基因GA/AA型患者服藥3 d后INR進(jìn)入治療范圍(1.8～3.0)的例數(shù)明顯高于EPHX1基因GG型(P＜0.05)。見表5。

二、維持劑量組基本資料及維持劑量的研究

維持劑量組的患者基本資料見表2。平均每日華法林劑量為(3.01±1.05)mg，每日服用最高劑量為6.88 mg，最低為0.83 mg;平均每周華法林劑量為(21.02±7.45)mg，每周服用最高劑量為48.13 mg，最低為5.78 mg。

表2 入組患者基本信息

表3 初始療效相關(guān)基因因素篩選

表4 不同基因型間的影響因素分析

表5 不同基因型間的終點(diǎn)事件的差異

CYP2C9(rs1057910)及VKORC1(rs9923231)之間每日華法林劑量及每周華法林劑量存在明顯差異。非基因因素中，房顫患者華法林維持劑量為(2.91±0.88)mg/d、心臟瓣膜置換患者為(3.03±1.11)mg/d、肺栓塞患者為(3.27±1.42)mg/d、深靜脈血栓患者為(2.86±0.61)mg/d，單因素方差分析顯示不同病因組間華法林維持劑量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。單因素統(tǒng)計結(jié)果顯示胺碘酮、體重、BSA、年齡吸煙、飲酒、糖尿病和性別均與維持劑量不相關(guān)。見表6。

表6 華法林相關(guān)基因不同基因型間每日及每周華法林劑量的比較

討 論

口服抗凝藥物華法林廣泛用于臨床，主要面向靜脈和動脈血栓栓塞疾病患者。但由于華法林個體間的劑量差異較大，受年齡、體重、相關(guān)基因多態(tài)性、其它藥物使用和飲食習(xí)慣等的影響。近年來，對于華法林藥物基因組學(xué)的研究主要關(guān)注初始抗凝治療階段和維持劑量。初始抗凝階段研究中所涉及的基因主要以CYP2C9和VKORC1為主［3-5］，而針對維持劑量的研究除和華法林代謝和作用相關(guān)的基因外，還包含與維生素K1體內(nèi)循環(huán)和代謝相關(guān)的基因如CYP4F2、GGCX和EPHX1等［6-8］。大多數(shù)研究均以非中國人群為研究對象。眾多研究均顯示基因突變的頻率存在顯著的種族差異，因此需要研究多基因?qū)χ袊鴿h族人群在華法林初始抗凝療效和維持劑量的影響。

本研究包括初始抗凝療效和維持劑量兩方面。針對初始抗凝療效，國內(nèi)學(xué)者主要研究的是CYP2C9和 VKORC1［4-5］。但除上述 2個基因以外，我們還對CYP4F2、GGCX和EPHX1這3個基因共5個SNPs位點(diǎn)對初始抗凝療效的影響進(jìn)行了研究。同時還設(shè)定了初始抗凝療效觀測指標(biāo)“△INR4-1”，通過該觀測指標(biāo)對所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析，得到在各基因組基礎(chǔ)INR均值均＜1.2的 前 提 下，CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和EPHX1(rs2292566)均與初始抗凝療效顯著相關(guān)。文獻(xiàn)報道CYP2C9和初始抗凝治療中發(fā)生的抗凝過度事件有關(guān)［9-10］。本研究中雖然INR＞3的患者有18例，INR＞4的患者有4例，但結(jié)果顯示CYP2C9(rs1057910)并不與初始抗凝期內(nèi)發(fā)生抗凝過度的事件顯著相關(guān)。這可能與我們僅研究初始3 d的抗凝療效，觀察期較短有關(guān)。另外，本研究群體首日劑量在2.5～3.75 mg之間，之后根據(jù)INR的檢測結(jié)果調(diào)整劑量。結(jié)果顯示該華法林初始給藥方式能使得大部分CYP2C9(rs1057910)AC/CC型患者在3日內(nèi)INR進(jìn)入有效治療范圍，而對于CYP2C9(rs1057910)AA型患者尚無法使得患者INR在3 d內(nèi)進(jìn)入有效治療范圍內(nèi)。由于CYP2C9(rs1057910)在中國漢族人群的等位基因突變頻率為4%［4～5，10］，在本研究中為4.54%，所占比例很低。因此本研究群體中的大部分患者在目前的給藥方式下無法盡快進(jìn)入有效治療范圍內(nèi)。

在維持劑量的研究中，研究對象均服用3個月以上的華法林，期間多次根據(jù)INR檢測結(jié)果對劑量進(jìn)行調(diào)整后，得到了個性化的維持劑量。研究發(fā)現(xiàn)CYP2C9和VKORC1的基因型對于維持劑量均存在顯著影響，CYP2C9(rs1057910)AC/CC型患者維持劑量更低，而VKORC1(rs9923231)GA型患者維持劑量更高，這與之前許多國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果［7，12-13］相一致。GU 等［7］在以中國漢族人群為對象，對華法林維持劑量的研究中發(fā)現(xiàn)EPHX1(rs4653436)攜帶“G”等位基因的患者需要更低的華法林維持劑量［GG、AG:(1.8±0.6)mg/d，AA:(2.2±1.1)mg/d，P＜0.05］，但該結(jié)果并沒有在研究中得以體現(xiàn)。CEN等［6］對CYP4F2 rs2108622在中國人群的分布以及對于華法林維持劑量的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示CC型患者其維持劑量為(2.9±1.1)mg/d，明顯低于CT型和 TT 型患者［(3.2±1.1)mg/d，P＜0.05］。此結(jié)論在本研究中并沒有重現(xiàn)。HUANG等［8］同樣針對中國漢族人群研究GGCX 3261對華法林維持劑量的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)GGCX3261 GG型和AA型2組間維持劑量存在明顯差異(P＜0.05)。而在研究中雖然GG型所需劑量要比AA型低0.27 mg/d，但是統(tǒng)計結(jié)果顯示該差異并不顯著(P＞0.05)。本研究還通過排除基因影響因素，驗證了鹽酸胺碘酮與華法林共同使用時對華法林維持劑量有明顯影響，即同時服用胺碘酮的患者所需的華法林維持劑量更低。

本研究驗證了CYP2C9和VKORC1對華法林初始抗凝療效和維持劑量均有明顯的影響。眾多研究均認(rèn)為，如果針對服用華法林藥物的患者，根據(jù)其個人的個性化信息包括年齡、體重、合并用藥等，同時在服用華法林前進(jìn)行 CYP2C9(rs1057910)、VKORC1等相關(guān)基因的SNPs檢測，可使患者能夠更為安全有效的進(jìn)行抗凝治療。國外許多研究學(xué)者和部分國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)通過逐步多重線性回歸的方式對患者所需的華法林維持劑量進(jìn)行公式化，大部分維持劑量公式約可以解釋40%～60%的個體間劑量差異［14］。部分學(xué)者還通過前瞻性研究的方式通過基于華法林藥物基因?qū)W的給藥方式對初始用藥患者的抗凝療效進(jìn)行研究，得到了較好的結(jié)果［3，15～16］。因此我們將以本研究的結(jié)果作為基礎(chǔ)，建立華法林藥物基因?qū)W相關(guān)的劑量方程，并進(jìn)一步在更大樣本的人群中進(jìn)行驗證。

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