賈敏，張銀志，張亦凡，孫秀蘭*，

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214122；3.漢中市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西漢中 723000）

牛奶β-乳球蛋白質(zhì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

賈敏1，張銀志2，張亦凡3，孫秀蘭*1，2

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214122；3.漢中市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西漢中 723000）

建立一種快速、特異、靈敏的Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）方法，用于牛奶主要過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)的檢測(cè)。根據(jù)GenBank登錄的牛β-乳球蛋白質(zhì)的DNA序列設(shè)計(jì)，合成一對(duì)特異性引物和探針。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)序鑒定，10倍梯度稀釋含有β-乳球蛋白質(zhì)基因的重組質(zhì)粒，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)該方法的特異性、穩(wěn)定性、靈敏性，同時(shí)將建立的方法用于10種市售食品的檢測(cè)。成功建立了β-乳球蛋白質(zhì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值與模板濃度在3.18× 103～3.18×107copies范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2值為0.997 8；檢測(cè)靈敏度高（318 copies/μL）；特異性強(qiáng)，對(duì)羊奶、豆?jié){DNA均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)；穩(wěn)定性好，組內(nèi)、組間的變異系數(shù)均在5%以內(nèi)。對(duì)10種食品牛奶過(guò)敏原的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽相符。表明所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可應(yīng)用于食品中牛奶過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)的檢測(cè)并可推廣到其它過(guò)敏原的檢測(cè)。

牛奶過(guò)敏原質(zhì)；β-乳球蛋白質(zhì)；Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR法；檢測(cè)

牛乳及乳制品是常見(jiàn)的八大食物過(guò)敏原之一，牛乳過(guò)敏（CMA）是由于攝入乳或含有乳制品的食物而引起的異常免疫反應(yīng)，尤其影響嬰幼兒及兒童（3歲以內(nèi)）的身體健康，其發(fā)病率高達(dá)7.5%［1-4］。牛乳致敏蛋白質(zhì)主要有酪蛋白質(zhì)、β-乳球蛋白質(zhì)、α-乳白蛋白質(zhì)以及牛血清蛋白質(zhì)等，其中β-乳球蛋白質(zhì)被認(rèn)為是其中重要的致敏蛋白質(zhì)之一［5］。β-乳球蛋白質(zhì)是一種重要的乳清蛋白質(zhì)，約占牛乳總蛋白質(zhì)的十分之一，其一級(jí)結(jié)構(gòu)含有162個(gè)氨基酸殘基，分子量約為18.4 kDa，存在兩種基本形式，分別為變異體A和B［6］。β-乳球蛋白質(zhì)不存在于母乳中，且不能被胃蛋白酶消化水解，因此可通過(guò)胃腸道進(jìn)入血液循環(huán)［7］。因而被認(rèn)為是牛乳中最主要的過(guò)敏原，刺激嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)生超敏反應(yīng)。研究表明：約82%的牛乳過(guò)敏病人都對(duì)β-乳球蛋白質(zhì)過(guò)敏［8］。

目前，β-乳球蛋白質(zhì)檢測(cè)方法主要有兩種：直接檢測(cè)致敏性蛋白質(zhì)的免疫學(xué)方法，如放射性變應(yīng)原吸附試驗(yàn)（RAST）［9］，酶標(biāo)記過(guò)敏原吸附抑制（EAST）［10］，火箭免疫電泳法（RIE）［11］，酶聯(lián)免疫法（ELISA）［12］；間接指示過(guò)敏原組分存在的特異性DNA片段，主要是PCR［13-14］。酶聯(lián)免疫法（ELISA）可直接檢測(cè)出致敏性蛋白質(zhì)，具有快速、靈敏、可商業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的過(guò)敏原檢測(cè)法［15-17］。但逐漸發(fā)現(xiàn)ELISA存在以下缺點(diǎn)：特異性抗體難獲得，復(fù)雜的生物基質(zhì)容易導(dǎo)致假陽(yáng)性，加工過(guò)程酶、溫度、壓力破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。而近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其定量準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于食品安全檢測(cè)。DNA比較穩(wěn)定，食品加工對(duì)其影響較小，因而基于DNA的常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以作為蛋白質(zhì)檢測(cè)的補(bǔ)充方法。目前許慶金［18］等人建立了基于β-乳球蛋白質(zhì)基因的常規(guī)PCR定性檢測(cè)方法，但還未見(jiàn)β-乳球蛋白質(zhì)基因的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)針對(duì)牛奶β-乳球蛋白質(zhì)的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，首次建立牛奶β-乳球蛋白質(zhì)過(guò)敏原的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，特異性檢測(cè)食物中牛奶主要過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)，并應(yīng)用于市售食物中牛奶過(guò)敏原組分的快速檢測(cè)，確保該方法的可靠性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶、餅干、蛋糕、飲料等食品，購(gòu)于無(wú)錫歐尚超市。pMD19T-Vector Cloning Kit，PCR膠回收試劑盒，質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒，2X PCR Master Mix，大連Takara公司提供；引物及探針（HPLC純化），由上海生工生物工程有限公司合成；溴化乙錠（EB），TBE緩沖液，瓊脂糖，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；Tris-飽和酚、氯仿、乙醇及異戊醇等其它常規(guī)分析純?cè)噭?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；感受態(tài)菌，氨芐青霉素，LB培養(yǎng)基，由上海博仕生物醫(yī)學(xué)服務(wù)中心（水源生物）提供。

1.2 儀器與設(shè)備

伯樂(lè)C1000TM型PCR儀，凝膠成像儀，美國(guó)Bio-rad（伯樂(lè)）公司制造；SLAN?全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，上海宏石醫(yī)療科技有限公司制造；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一制造廠制造；TU-1900型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司制造。

1.3 DNA的提取

參照田雨［19］、徐仙［20］等提取方法并稍加改動(dòng)，提取市售鮮牛奶中的DNA：

1）取50 mL鮮牛奶置于4個(gè)100 mL的離心管中，4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，用棉球去除上層乳蛋白質(zhì)和乳脂；

2）加入10 mmol/L PBS，溶解沉淀，4℃，12 000 r/ min離心10 min；

3）加入880 μL TEN（1 mL l mol/L Tris+0.2 mL 0.5mol/LEDTA+58gNaCl定容至100mL）和0.2moI/L NaOH溶液120 μL，懸浮沉淀并震蕩混勻30 s，95℃條件下水浴8 min，期間顛倒混勻幾次，4℃、12 000 r/ min離心10 min；

4）取上清液至滅菌離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（體積比25：24：1），劇烈震蕩2～3 min，4℃，12 000 r/min離心10 min；

5）取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，12 000 r/min離心10 min；

6）上清液移入滅菌離心管，加入等體積預(yù)冷異丙醇，慢慢上下顛倒30s，-20℃條件放置30min；12000r/ min離心2 min，管底部有可見(jiàn)的白色DNA沉淀；

7）白色沉淀以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌2次，用N2氣吹干至無(wú)乙醇味；

8）加50 μL TE緩沖液溶解，測(cè)其濃度；

9）用CTAB［21-22］法進(jìn)行牛奶飲料及餅干樣品的DNA提取。

1.4 引物和探針

根據(jù)NCBI上已公布的牛奶過(guò)敏原，將β-乳球蛋白質(zhì)（β-Lg）基因的核酸序列，充分考慮檢測(cè)引物和探針的退火溫度的一致性、GC含量的相似性等因素，采用Primer select軟件設(shè)計(jì)合成檢測(cè)牛奶β-乳球蛋白質(zhì)成分的引物和Taqman-BHQ探針，PCR目標(biāo)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為226 bp。通過(guò)GenBank的Blast功能尋找該引物和探針的同源性，結(jié)果顯示該基因具有很高的特異性，其他基因與該基因的同源性較小。引物和探針的序列見(jiàn)下表1。

表1 擴(kuò)增β-乳球蛋白質(zhì)的引物和探針Table 1Primers and Probe sequence for PCR detection of β-lactoglobulin

1.5 牛奶定性PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

用上述引物對(duì)3種市售鮮牛奶DNA進(jìn)行擴(kuò)增，每種樣品都設(shè)置了3種退火溫度（50，55，60℃），PCR擴(kuò)增總體系30 μL：PCR Mixture 2×Mix 15 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），DNA模板2 μL，余下體積用滅菌超純水補(bǔ)足至30 μL。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，即在30 μL PCR體系中用等量超純水代替DNA模板。PCR反應(yīng)條件為起始模板預(yù)變性95℃，3 min；循環(huán)體：變性95℃30 s，退火（50、55、60℃）30 s，延伸72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

將上述PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)：將3 μL 6×Loading Buffer與6 μL PCR產(chǎn)物混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，在TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，以DNA Maker 1000作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，100 V電泳45 min，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.6 目的基因與載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

1.6.1 連接按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR膠回收純化，以TaKara的pMD19-T vector作為載體進(jìn)行連接，10 μL連接體系為：PCR回收片段4 μL，pMD19-T vector 1 μL，T4ligase 1 μL，10×T4ligase buffer 1 μL， dH2O 3 μL。16℃1 h，然后4℃過(guò)夜，第2天轉(zhuǎn)化。

1.6.2 轉(zhuǎn)化用氯化鈣法將連接產(chǎn)物（10 μL）轉(zhuǎn)入E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min。42℃靜止水浴45 s，再冰浴1 min。加入1 mL無(wú)抗性的LB，37℃，150r/min，復(fù)蘇40min。12000r/min離心1min，去掉1 μL上清液，剩下的混勻涂于帶有藍(lán)白斑篩選氨芐抗性的培養(yǎng)板。培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱，37℃過(guò)夜。

1.6.3 菌落PCR和測(cè)序鑒定以單菌落為模板進(jìn)行陽(yáng)性克隆菌落PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同熒光定量PCR。瓊脂糖電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增結(jié)果。將初步鑒定為陽(yáng)性的菌落接種LBA液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，第2天抽提并純化質(zhì)粒DNA。重組質(zhì)粒測(cè)序，驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。其同源性比較采用Gene Bank中的BLAST進(jìn)行分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將重組質(zhì)粒pMD19T-Lg用HindIII單酶切成線性化的標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒并定量，線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的拷貝數(shù)為3.18×109，按10倍梯度稀釋?zhuān)x擇3.18×103～3.18×107拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Taqman探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)體系為：總體積30 μL，其中含2×qPCR mix 15 μL，上下游引物各0.5μL（10μmol/L），探針1μL（10μmol/L），模板DNA 2 μL，滅菌超純水11 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR運(yùn)行條件同定性PCR優(yōu)化好的條件：95℃3 min；94℃30 s；55℃30 s，72℃30 s檢測(cè)熒光信號(hào)，30個(gè)循環(huán)，72℃保溫10 min。以初始模板量對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值（Ct）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

為對(duì)本研究中建立的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的實(shí)用性進(jìn)行考察，對(duì)10種食品牛奶過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。利用CTAB法對(duì)牛奶飲料及餅干基因組DNA進(jìn)行提取，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其β-乳球蛋白質(zhì)過(guò)敏原基因拷貝數(shù)，利用檢測(cè)限來(lái)判斷實(shí)際樣品是否含有牛奶β-乳球蛋白質(zhì)過(guò)敏原。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶基因組DNA的提取

經(jīng)測(cè)定提取的DNA基因組的OD260/OD280在1.7左右，DNA純度較好，濃度較高，可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。見(jiàn)表2。

表2 樣本基因組DNA測(cè)定值Table 2Detection results of DNA obtained from food samples

2.2 PCR定性分析

分別以提取的光明、現(xiàn)代、特侖蘇鮮牛奶基因組DNA為模板進(jìn)行定性PCR檢測(cè)，PCR的電泳結(jié)果（圖1）表明，通過(guò)本研究中設(shè)計(jì)的引物可從商業(yè)牛奶基因組DNA中擴(kuò)增出牛的β-乳球蛋白質(zhì)的預(yù)期條帶，且退火溫度為55℃時(shí)條帶較亮，擴(kuò)增效率較高，因此選用55℃進(jìn)行后續(xù)定量的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。根據(jù)此結(jié)果將擴(kuò)增得到的PCR條帶進(jìn)行割膠回收做T/A克隆，構(gòu)建pMD19T-Lg載體。

圖1 不同牛奶基因組DNA及退火溫度的定性PCR產(chǎn)物Fig.1PCR products from extracted genomic DNA of three commercial milk with different annealing temperature.

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后挑取5個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖電泳。圖2為菌落PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，在226 bp處出現(xiàn)條帶，與目的片段大小一致，初步判斷為陽(yáng)性克隆。

圖2 重組質(zhì)粒菌落PCR結(jié)果Fig.2Colony PCR analysis of the recombinant plasmid

選取亮度最大的1、2號(hào)菌落接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI上的blast進(jìn)行同源性比對(duì)分析。結(jié)果表明，克隆的序列與GenBank中已登錄的牛的β-乳球蛋白質(zhì)基因序列完全一致，同源性達(dá)到100%。說(shuō)明插入的外源基因即為目的片段，即重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。標(biāo)準(zhǔn)模板測(cè)序結(jié)果如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)模板β-乳球蛋白質(zhì)基因片段DNA測(cè)序結(jié)果Fig.3DNA sequence analysis of β-Lg allergen gene fragment as a standard template

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將重組質(zhì)粒pMD19T-Lg用HindIII進(jìn)行單酶切，回收線性化的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋作為擴(kuò)增模板，每個(gè)梯度重復(fù)3次測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3.18×107～3.18×103拷貝數(shù)范圍內(nèi)，Ct值與模板DNA分子的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系（見(jiàn)圖4），以基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2為0.997 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為

式中：y為循環(huán)閾值（Cycle Threshold，Ct）；x為質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值（見(jiàn)圖5）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和樣品的Ct值便可計(jì)算出樣品中所測(cè)組分DNA的含量。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 靈敏度分析取β-Lg重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋?zhuān)?，31，3.18×102，3.18×103，3.18×104，3.18× 105copies/μL），以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，最小檢測(cè)拷貝數(shù)屬318 copies/μL的β-Lg樣品。見(jiàn)圖6。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒pMD19T-Lg DNA系列梯度的擴(kuò)增曲線Fig.4Establishment of amplification curve for detection of α-La DNA template by Real-time PCR

圖5 牛奶β-乳球蛋白質(zhì)Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5Standard curve for detection of milk β-La gene by real-time PCR

圖6 熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)Fig 6Sensitivity tests of real-time PCR

2.5.2 特異性分析為考察所建立的Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè)法是否能特異性針對(duì)牛奶β-乳球蛋白質(zhì)基因，以鮮牛奶基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，提取羊奶、豆?jié){，牛奶飲料、牛奶餅干食物基因組DNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳。見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示，僅牛奶及奶制品食物基因組DNA擴(kuò)增出目的片段，羊奶及豆?jié){基因組DNA擴(kuò)增均成陰性。說(shuō)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有較好的特異性。

圖7 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)Fig.7 Specificity tests of real-time PCR

2.5.3 重復(fù)性分析選擇濃度為3.18×103、3.18× 105、3.18×107copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。組內(nèi)：同一時(shí)間同一反應(yīng)條件下，對(duì)3個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次試驗(yàn)，分析組內(nèi)重復(fù)性。組間：6 d內(nèi)對(duì)3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別單獨(dú)進(jìn)行3次Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定，分析組間重復(fù)性。結(jié)果如表3所示，變異系數(shù)CV均在5%以內(nèi)，說(shuō)明建立Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性較好。

表3 熒光定量PCR的重復(fù)性結(jié)果Table 3Reproducibility test of the real-time PCR

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用建立的熒光定量PCR方法對(duì)10種食品中的牛奶主要過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)基因進(jìn)行檢測(cè)，以復(fù)原乳為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照。利用田雨提取牛奶DNA法［19］，對(duì)液體樣品進(jìn)行基因組DNA提取，利用改進(jìn)的CTAB法對(duì)餅干等固體食品的基因組DNA進(jìn)行提取，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。根據(jù)本研究的靈敏度318 copies/μL來(lái)考察食品是否含有牛奶β-乳球蛋白質(zhì)過(guò)敏原。表4為檢測(cè)結(jié)果，8種標(biāo)簽標(biāo)示牛奶過(guò)敏原的食品中7種β-乳球蛋白質(zhì)檢測(cè)呈陽(yáng)性，其中果粒奶優(yōu)雖然標(biāo)示有牛奶，但是重復(fù)3次檢測(cè)結(jié)果均為陰性，推斷可能原因?yàn)楣Ｄ虄?yōu)飲料含有牛奶量較少或食品加工過(guò)程對(duì)DNA破壞較大，影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果。豆?jié){及果汁檢測(cè)結(jié)果均為陰性，與標(biāo)示一致。檢測(cè)結(jié)果表明，建立的熒光定量PCR法用于食品檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，符合率達(dá)90%，可用于市售食品的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)。

表4 市售食品中牛奶過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果Table 4Detection results of commercial food

3 討論

為避免消費(fèi)者誤食過(guò)敏原導(dǎo)致嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，提供消費(fèi)者清晰準(zhǔn)確的食物過(guò)敏原信息至關(guān)重要。因此，美國(guó)（USA）和歐盟（EU）近來(lái)都制定了規(guī)范食品過(guò)敏原標(biāo)簽的法律法規(guī)。2010年我國(guó)修訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T23779—2009預(yù)包裝食品中的致敏原成分》，要求食品標(biāo)簽增加牛奶等其他過(guò)敏原的標(biāo)識(shí)。因此，迫切需要建立快速、靈敏、特別的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)方法，以為食品過(guò)敏原的標(biāo)識(shí)提供支持保障。

本研究中根據(jù)NCBI登錄的β-乳球蛋白質(zhì)核酸序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和探針，對(duì)目標(biāo)基因β-乳球蛋白質(zhì)的一段DNA序列進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，在3.18×107～3.18×103拷貝數(shù)范圍內(nèi)，Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對(duì)目的基因濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。與許慶金等人建立的β-乳球蛋白質(zhì)常規(guī)PCR檢測(cè)方法相比，Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR可省去電泳步驟、簡(jiǎn)便安全、靈敏度高、特異性強(qiáng)，并且實(shí)現(xiàn)了定性PCR到定量PCR的飛躍。用本研究中設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)羊奶、豆?jié){及餅干、飲料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示該檢測(cè)方法特異性針對(duì)牛奶β-乳球蛋白質(zhì)，靈敏度達(dá)到318 copies/μL。根據(jù)建立的靈敏度對(duì)10種食品進(jìn)行檢測(cè)，除果粒奶優(yōu)飲料檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽不符，推測(cè)該飲料DNA破壞嚴(yán)重或含量較低影響檢測(cè)，其他食品檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽過(guò)敏原標(biāo)識(shí)一致，說(shuō)明該方法具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性。

4 結(jié)語(yǔ)

作者建立的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，用于食品中牛奶主要過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)基因的檢測(cè)，為食品致敏原的標(biāo)簽管理和檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支持。Taqman實(shí)時(shí)熒光定量法可定量分析食品中β-乳球蛋白質(zhì)含量，與常規(guī)PCR方法相比具有靈敏、快速、特異、簡(jiǎn)單、安全等優(yōu)點(diǎn)。與直接檢測(cè)致敏性蛋白質(zhì)的免疫分析方法相比，可大大降低復(fù)雜生物基質(zhì)中交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果，避免對(duì)大量抗體的需求，而DNA比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，受食品加工條件影響較小，因此可通過(guò)對(duì)過(guò)敏原DNA片段的檢測(cè)間接指示食物過(guò)敏原組分的存在?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)中建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可作為目前常用的免疫檢測(cè)的有效補(bǔ)充，為食物牛奶過(guò)敏原的檢測(cè)提供可靠的保障，可推廣到食品中牛奶過(guò)敏原實(shí)際的檢測(cè)。

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Establishment of a Taqman Real-Time Quantitative PCR for the Detection of β-Lactoglobulin Gene

JIA Min1，ZHANG Yinzhi2，ZHANG Yifan3，SUN Xiulan*1，2
（1.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Hanzhong Products Quality Supervision and Inspection Institute，Hanzhong 723000，China）

The research aimed to establish a Taqman real-time fluorescence quantitative assay for the rapid detection of milk allergen β-lactoglobulin in food.Specific primers and Taqman probe were first designed based on the gene sequence of β-lactoglobulin for real-time PCR.The purified DNA product was linked with the pMDl9-T vector to construct recombined plasmids as a standard PCR template.Plasmids were then identified with colony PCR and subjected to sequencing.Real-time fluorescence PCR assay was performed with plasmids and the standard curve was constructed with DNA copies and Ct.Sensitivity，specificity，reproducibility and application of the real-time method were also evaluated.Results showed that the β-lactoglobulin DNA fragment was successfully clonedand the standard curve had a good linear relationship ranging from 3.18×103to 3.18×107copies.The detection sensitivity reached up to 318 copies/μL.Furthermore，specificity and stability of the method were good.Ten foods were detected with the β-Lg DNA residue and the results were consistent well with their allergen labels.Therefore，the method may become a complementary tool for milk allergen detection and it is applicable for other food allergens.

milk allergen，β-lactoglobulin，Taqman real-time quantitative PCR，detection

52.1；TS252.7

A

1673—1689（2015）06—0605—08

2014-06-30

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAK10B03）

*通信作者：孫秀蘭（1976-），女，山東聊城人，工學(xué)博士，教授，主要從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail：sxlzzz@yahoo.com.cn