侯玉柱，田雨，柯潤(rùn)輝，尹建軍，宋全厚

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

食品生產(chǎn)用水、醫(yī)療用水等微菌含量樣品中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定是目前微生物測(cè)定的難點(diǎn)之一［1］。多數(shù)微生物快速檢測(cè)技術(shù)都是利用膜過(guò)濾方法富集細(xì)菌后進(jìn)行測(cè)定，膜過(guò)濾富集細(xì)菌的主要機(jī)理是機(jī)械篩分作用和吸附截留作用［2－4］，尺寸較大的微生物(大多數(shù)細(xì)菌)主要通過(guò)機(jī)械篩分作用截留細(xì)菌，尺寸較小的微生物(大部分病毒)則依靠吸附截留作用。對(duì)于膜過(guò)濾富集方法而言，影響膜過(guò)濾的因素眾多，例如濾壓、pH 值、濾液溫度、過(guò)濾體積等［5］，然而操作條件能夠通過(guò)成型的操作規(guī)范或標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行約束，膜孔徑及膜材質(zhì)等客觀因素是膜過(guò)濾效果的主要影響因素。本文通過(guò)對(duì)比不同材質(zhì)、不同孔徑的微孔濾膜的細(xì)菌截留效果及測(cè)定結(jié)果，優(yōu)選出適用于ATP微生物快檢法濾膜富集、膜上測(cè)定法測(cè)定微菌含量樣品中的細(xì)菌總數(shù)［6］。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

ATP熒光檢測(cè)儀(SF0012型)，中質(zhì)賽福(北京)科技儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器、高壓滅菌鍋、移液槍(5～50 μL)、一次性注射器(50 mL);過(guò)濾器(適用于直徑13 mm的微孔濾膜，可重復(fù)使用，先用75%酒精浸泡，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，無(wú)菌條件下晾干備用);小鑷子(塑料材質(zhì)，用酒精浸泡再用無(wú)菌水沖洗，晾干后備用)。

1.2 試劑

復(fù)合熒光試劑(ZF0011)，中質(zhì)賽福(北京)科技儀器有限公司;PCA培養(yǎng)基、5%生理鹽水(自配);待濾樣液(用未消毒臺(tái)面涂抹洗脫菌懸液自配，以GBT4789.2－2010［7］檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，用無(wú)菌生理鹽水稀釋2倍、4倍和10倍，原液及稀釋液備用)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

混合纖維素酯膜(d=13 mm，孔徑0.22 μm和0.45 μm);聚碳酸酯膜(d=13 mm，孔徑 0.2 μm 和0.4 μm);醋酸纖維素膜(d=13 mm，孔徑 0.22 μm和0.45 μm);硝酸纖維素膜(d=13mm，孔徑0.22 μm 和0.45 μm)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 細(xì)菌富集方法

將0.22 μm孔徑和0.45 μm孔徑的4種濾膜分別裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊壓平，包裝，滅菌后待用(0.1 MPa，121.5℃滅菌20 min)，用50 mL無(wú)菌注射器吸取50 mL按1.2小節(jié)制備的4倍稀釋備用液，將滅菌濾器的入口在無(wú)菌條件下，以無(wú)菌操作方式連接于裝有待濾溶液的注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無(wú)菌試管中。將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過(guò)濾到無(wú)菌試管中，濾畢，將針頭撥出。壓濾時(shí)，每次用力要一致且適當(dāng)，不可太猛太快，以免壓力變化太大影響截留效果，每種濾膜做5次平行試驗(yàn)。

2.2.2 細(xì)菌截留率計(jì)算

將2.2.1小節(jié)中帶橡皮塞的無(wú)菌試管中的濾液用渦旋振蕩器振蕩均勻，以GB4789.2－2010方法測(cè)定濾液中殘留的細(xì)菌總數(shù)。

濾膜細(xì)菌截留率/%=［(待濾樣液細(xì)菌濃度×過(guò)濾體積)－(濾液細(xì)菌濃度×過(guò)濾體積)］/(待濾樣液細(xì)菌濃度×過(guò)濾體積)×100

2.2.3 ATP熒光微生物快檢法

將2.2.1小節(jié)中過(guò)濾器無(wú)菌狀態(tài)打開(kāi)，用無(wú)菌小鑷子將濾膜取出，轉(zhuǎn)移至ATP熒光檢測(cè)特制樣品杯中，用移液槍滴加25 μL復(fù)合熒光試劑至膜上，再加200 μL無(wú)菌水至膜上，用移液槍來(lái)回吹吸4～5次，推入儀器測(cè)定，得出膜上細(xì)菌總ATP熒光值，考察各種材質(zhì)濾膜膜上裂解測(cè)定的重復(fù)性。

2.2.4 梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將按1.2小節(jié)中配制好的4個(gè)濃度的待濾樣液，每個(gè)濃度均用2.2.1中所述細(xì)菌富集方法，用0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜過(guò)濾富集50 mL待濾樣液后，用2.2.3中所述的ATP熒光微生物快檢法檢測(cè)的熒光值，對(duì)結(jié)果做線性相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 截留效果統(tǒng)計(jì)及分析

1.2中用未消毒臺(tái)面涂抹洗脫自配的菌懸液經(jīng)過(guò)GB4789.2－2010測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 制備菌懸液細(xì)菌總數(shù)含量 單位:CFU/mLTable 1 Total bacteria number of prepared suspension

從表1國(guó)標(biāo)測(cè)定的結(jié)果可以得出，自制菌懸液濃度為42 CFU/mL，由此可以推算出不同稀釋倍數(shù)后的稀釋液的含菌量，為后面梯度實(shí)驗(yàn)效果的計(jì)算提供數(shù)據(jù)。

按照2.2.1中描述的方法過(guò)濾待濾樣品，按照2.2.2中所描述的方法計(jì)算截留率，得出4種濾膜在相同的操作條件下過(guò)濾50 mL樣液所得細(xì)菌截留率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 四種濾膜截留效果統(tǒng)計(jì)分析表Table 2 Statistical analysis of four kinds of membrane intercept effect

從表2中可以得出，在相同的操作條件下，同一材質(zhì)濾膜孔徑為0.22 μm(或0.2 μm)的截留效果優(yōu)于 0.45 μm(或 0.4 μm)的，因此選擇 0.22 μm(或0.2 μm)孔徑的濾膜過(guò)濾細(xì)菌更為可行。再對(duì)不同材質(zhì)的0.22 μm孔徑濾膜做比較:實(shí)驗(yàn)中0.22 μm混合纖維素酯膜的平均截留率為100%，優(yōu)于聚碳酸酯膜的94%、醋酸纖維素膜的84%以及硝酸纖維素膜的72%，由此可以得出，孔徑為0.22 μm的混合纖維素酯膜對(duì)細(xì)菌的截留效果最好。

3.2 ATP熒光法膜上裂解測(cè)定重復(fù)性評(píng)價(jià)

從表3可以得出，經(jīng)過(guò)5次平行測(cè)定，混合纖維素酯膜上 ATP熒光值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.0%，低于聚碳酸酯膜、醋酸纖維素膜及硝酸纖維素膜的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(后3者 RSD分別為6.1%、14.1%和19.5%)，具有更好的重復(fù)性。因此，在以ATP生物發(fā)光法測(cè)定低菌含量液體樣品中的細(xì)菌總數(shù)時(shí)，孔徑為0.22 μm的混合纖維素酯膜最適合用于過(guò)濾截留液體樣品中的細(xì)菌。

表3 0.22 μm孔徑膜上總ATP測(cè)定重復(fù)性分析(n=5)Table 3 Total ATP measurement repeatability analysis of membrane in 0.22 μm aperture(n=5)

3.3 梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證效果分析

從圖1可以得出，在其他操作條件相同的情況下，使用0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜過(guò)濾不同濃度的菌懸液，膜上的ATP熒光值與待測(cè)樣液的細(xì)菌含量的相關(guān)系數(shù)R2為0.954 3，說(shuō)明二者之間具有良好的線性相關(guān)性。

表4 不同濃度待濾樣液過(guò)濾后膜上測(cè)定熒光值Table 4 Fluorescence value from membrane filtrate samples of different bacteria concentration

圖1 梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證效果線性分析圖Fig.1 Linear analysis of gradient experiment results

4 結(jié)論

目前，膜過(guò)濾技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得比較成熟。羅祎［8］、劉弋青［10］、Parveen［11］、嵇志遠(yuǎn)［12］、Namvar［13］等專家和學(xué)者均曾用微孔濾膜進(jìn)行微生物檢測(cè)，但僅評(píng)價(jià)了單一特定濾膜的細(xì)菌截留效果，并未對(duì)不同材質(zhì)、孔徑的微孔濾膜做對(duì)比研究。本研究在相同操作條件下，分析了微孔濾膜材質(zhì)及孔徑等客觀因素對(duì)細(xì)菌截留效果的影響，此項(xiàng)研究在業(yè)內(nèi)尚屬首次。

在相同的操作條件下，0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜能夠100%截留低菌含量水中的細(xì)菌，其細(xì)菌截留率和ATP熒光測(cè)定重復(fù)性皆優(yōu)于其他常用材質(zhì)和孔徑的微孔濾膜，ATP熒光值與國(guó)標(biāo)方法測(cè)定結(jié)果的線性相關(guān)性較好，線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.9。以上結(jié)論說(shuō)明，0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜最適用于ATP熒光微生物測(cè)定中細(xì)菌的富集與測(cè)定。

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［6］尹子波，侯玉柱，尹建軍，等.ATP生物發(fā)光技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33(2):228－232.

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