趙秋伶，史素青

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島 125105；2.西北大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，陜西西安 710069）

酶聯(lián)適體分析法檢測(cè)葡萄酒中的赭曲霉素A

趙秋伶1，史素青2

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島 125105；2.西北大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，陜西西安 710069）

建立了競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析方法，檢測(cè)葡萄酒中的赭曲霉素A（OTA）。核酸適體和OTA特異性結(jié)合導(dǎo)致與核酸適體雜交的短鏈DNA解鏈，解離的DNA作為捕獲元素，進(jìn)一步特異性結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶（HRP），HRP催化四甲基二苯胺（TMB）底物顯色，測(cè)定A450nm與濃度的線性關(guān)系，確定OTA的檢出限?？疾炝薉NA包被濃度、雜交溫度和封閉液等因素對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下，所建立的競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析法對(duì)OTA檢測(cè)有高靈敏度，檢測(cè)限0.88 μg/L，線性范圍1～100 μg/L在葡萄酒中添加時(shí)，加標(biāo)回收率為92.03%～106.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）小于2.1%，此方法可用于葡萄酒中OTA的快速測(cè)定。

赭曲霉素A；競(jìng)爭(zhēng)取代；酶聯(lián)適體分析；葡萄酒

赭曲霉素A（Ochratoxin A），簡(jiǎn)稱OTA，是赭曲霉、炭黑曲霉和青霉菌等的次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］，廣泛存在于谷類(lèi)、咖啡和葡萄等農(nóng)作物及相關(guān)產(chǎn)品中［2］，可經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類(lèi)健康造成巨大威脅。OTA毒性很大，可損傷人類(lèi)的肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)［3］，并有致畸、致突變和致癌作用［4］。2006年，歐盟調(diào)查顯示，人類(lèi)從葡萄酒中攝取的OTA含量占總量的13%，僅次于谷類(lèi)［5］。至此，葡萄酒中OTA的檢測(cè)成為各國(guó)食品安全分析的新熱點(diǎn)。歐盟規(guī)定［6］葡萄酒中OTA的最大限量為2 μg/ L，我國(guó)尚未制定限量標(biāo)準(zhǔn)。目前葡萄酒中OTA檢測(cè)主要有高效液相法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［7-8］。HPLC法所用儀器昂貴、對(duì)樣品的預(yù)處理步驟復(fù)雜、檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)。ELISA彌補(bǔ)了HPLC的不足，可滿足大批量樣品和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等要求，但抗體易受外界條件的影響，檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率高，只能作為儀器分析前的排查方法。

核酸適體（Aptamer）是高親和性和高特異性結(jié)合目標(biāo)分子的單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）［9］。與抗體相比，核酸適體容易合成和標(biāo)記，具有良好的穩(wěn)定性，且成本低［10］。用核酸適體代替抗體發(fā)展ELISA，可以降低ELISA的成本，同時(shí)降低假陽(yáng)性率。OTA的核酸適體已被成功篩選［11-12］，用核酸適體做識(shí)別元素的直接競(jìng)爭(zhēng)和間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)分析法已被成功建立［12］，檢測(cè)原理和抗體做識(shí)別元素的檢測(cè)完全相同，且都是顯色淺者為陽(yáng)性。關(guān)于具有新型檢測(cè)機(jī)理的酶聯(lián)適體分析方法研究甚少，因此作者旨在通過(guò)用雙鏈核酸適體作識(shí)別元素，建立顯色深者為陽(yáng)性的競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析方法，檢測(cè)葡萄酒中的OTA。顯色深者為陽(yáng)性，顯色結(jié)果更容易被裸眼觀察。該方法豐富了核酸適體免疫分析法的實(shí)際應(yīng)用，為保障酒類(lèi)質(zhì)量安全提供了一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赭曲霉素A（OTA）、N-乙酰-L-苯丙氨酸（NAP）、華法林（Warfarin）、赭曲霉素B（OTB）和黃曲霉素B1（AFB1）：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。生物素（biotin）標(biāo)記的OTA核酸適體序列：5′-biotin-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3′（DNA1）；和DNA1部分互補(bǔ)的異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的核酸序列：5′-FITC-CGC CAC CCA CAC CCG CAG-3′（DNA2）；和DNA2完全互補(bǔ)的核酸序列：5′-biotin-CTG CGG GTG TGG GTG GCG-3′（DNA3）；無(wú)標(biāo)記的其它核酸序列（見(jiàn)表1）；均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。所有核酸在使用前都用超純水配成100 μmol/L的儲(chǔ)備液。鏈霉親和素包衣的酶標(biāo)板和四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液：購(gòu)自美國(guó)ThermoScientific公司；Anti-FITC-HRP：購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其它試劑均為分析純。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的其它核酸序列Table 1Other DNA sequences used in the experiment

包被核酸適體用PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH= 7.4）；洗滌用PBST緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4，含2 mmol/L MgCl2和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%Tween 20）；結(jié)合緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，20 mmol/L CaCl2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%Tween 20，pH= 8.5。2 g/L OTA及相關(guān)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇自行配制，4℃冰箱保存使用。葡萄酒樣品，購(gòu)自西安超市，乙醇體積分?jǐn)?shù)11%。

Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司制造；冷凍離心機(jī)、微量可調(diào)移液器：德國(guó)Eppendorf公司制造；SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司制造；搖床：德國(guó)IKA公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙鏈核酸適體的優(yōu)化向OTA結(jié)合緩沖液中加入10 nmol/L核酸適體序列（DNA1）及它的互補(bǔ)序列（a或b或c），于37℃孵育20 min以確保完全雜交形成雙鏈DNA（dsDNA）；然后加入適量的核酸染料SYBR Green I（SG），室溫下孵育10 min，確保SG插入雙鏈DNA小溝區(qū)域；最后滴加100 μg/L的OTA，室溫下孵育30 min，測(cè)定和OTA反應(yīng)前后的溶液的熒光光譜，SG的最大激發(fā)波長(zhǎng)為497 nm，收集500～650 nm的發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)為5 nm，計(jì)算熒光降低率。

1.2.2 核酸適體在酶標(biāo)板上的包被首先向包被緩沖液PBS中加入DNA1和DNA2配成溶液（DNA2的濃度是DNA1的1.05倍），于37℃孵育20 min，DNA1和DNA2雜交形成部分互補(bǔ)的dsDNA。鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板用200 μL洗滌緩沖液洗滌3次，每次5 min。洗滌完畢，酶標(biāo)板的每口加入100 μL dsDNA溶液，置于37℃搖床反應(yīng)1 h，通過(guò)生物素和鏈霉親和素的特異相互作用dsDNA包被到酶標(biāo)板凹槽，移去反應(yīng)液，凹槽用洗滌緩沖液洗3次，保留待用。采用相同的方法將DNA3包被到在另一鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板的凹槽，DNA3的濃度為DNA1濃度的2倍。包被完畢，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%乳粉做封閉反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間1 h，反應(yīng)完畢洗滌3次，保留備用。

1.2.3 競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析的檢測(cè)步驟OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液用結(jié)合緩沖液稀釋成系列濃度，分別加入到包被了dsDNA的酶標(biāo)板的凹槽中，每槽100 μL，室溫下孵育反應(yīng)30 min，反應(yīng)完畢用移液器吸出反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至包被了DNA3的酶標(biāo)板的凹槽中，于37℃搖床孵育反應(yīng)30 min，然后移去反應(yīng)液，用200 μL洗滌緩沖液洗滌3次，每次5 min。接著，每槽加100 μL按體積比1:5 000稀釋的Anti-FITC-HRP抗體，于37℃孵育30 min，移去反應(yīng)液，洗滌3次，最后加入TMB-H2O2底物顯色液，反應(yīng)30 min，藍(lán)色結(jié)果拍照。然后，用2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，藍(lán)色產(chǎn)物變黃，黃色產(chǎn)物用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm處的吸光度值。根據(jù)測(cè)量得到的吸光度，繪制吸光度與OTA濃度的曲線。

1.2.4 方法特異性評(píng)價(jià)比較了與OTA結(jié)構(gòu)類(lèi)似的兩種物質(zhì)：N-乙酰-L-苯丙氨酸（NAP）和華法林（Warfarin）的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)也考察了赭曲霉素B（OTB）和黃曲霉素B1（AFB1）對(duì)檢測(cè)的影響。以結(jié)合緩沖液作為陰性對(duì)照，用雙鏈核酸適體作為識(shí)別元素，用建立的競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)核酸適體法檢測(cè)。交叉反應(yīng)物的吸光度值為P，陰性孔吸光度值為N，計(jì)算P/N值。

1.2.5 實(shí)際樣品中OTA的添加回收實(shí)驗(yàn)選擇超市中2種葡萄酒，取1g上述樣品，添加3個(gè)不同質(zhì)量濃度（1、5、10 μg/L）的OTA。用建立的競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析法和酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒（北京康源泰博生物科技有限公司提供）檢測(cè)，計(jì)算得出樣品中OTA的實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量濃度，并按照以下公式（2）計(jì)算加標(biāo)回收率

2 結(jié)果與分析

2.1 雙鏈核酸適體的優(yōu)化

競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析方法是由作者所在實(shí)驗(yàn)室提出的，已成功用于ATP的檢測(cè)［13］，它的檢測(cè)原理是：核酸適體和靶標(biāo)的特異性結(jié)合導(dǎo)致和核酸適體雜交的另一短鏈DNA自雙鏈上解離，解離的DNA通過(guò)互補(bǔ)雜交被另一酶標(biāo)板上的DNA捕獲，進(jìn)一步捕獲辣根過(guò)氧化物酶，從而催化TMB底物顯色，顏色深淺和靶標(biāo)濃度成正比。競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析方法成功的關(guān)鍵在于核酸適體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)能發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，從dsDNA轉(zhuǎn)變成靶標(biāo)/aptamer復(fù)合物，即和核酸適體雜交的短鏈DNA在加入靶標(biāo)時(shí)發(fā)生解鏈。

為了得到結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換效率最高的dsDNA，優(yōu)化了不同位置互補(bǔ)的dsDNA序列。表1中核酸序列a、b、c和核酸適體DNA1雜交后形成雙鏈DNA，分別稱為dsDNA1、dsDNA2和dsDNA3。圖1示出了不同dsDNA/SG體系與OTA反應(yīng)前后溶液的熒光光譜，在522 nm處有最大發(fā)射。熒光降低率數(shù)據(jù)顯示dsDNA1和OTA反應(yīng)后，熒光降低率值最大達(dá)58.1%，這說(shuō)明dsDNA1和OTA發(fā)生反應(yīng)時(shí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換效率最高，因此選擇dsDNA1作為OTA的識(shí)別元素。

圖1 dsDNA/SG體系和OTA反應(yīng)前后的熒光光譜及熒光降低率Fig.1Fluorescence spectra and fluorescence decrease percentage of dsDNA/SG system before and after reaction with OTA

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

當(dāng)DNA2濃度為DNA1濃度的2倍時(shí)，對(duì)DNA1濃度進(jìn)行了優(yōu)化，考察了25、50、75、100、125、150 nmol/L的DNA1包被時(shí)，檢測(cè)1 000 μg/L的OTA實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖2）：DNA1濃度為100 nmol/L時(shí)，A450（450 nm處的紫外吸光度）值最大，表明此時(shí)微孔板已被DNA1飽和。所以，實(shí)驗(yàn)中DNA1包被濃度采用100 nmol/L。當(dāng)DNA1用量為100 nmol/L時(shí)，對(duì)DNA2包被濃度進(jìn)行了優(yōu)化，考察了DNA2為100、105、110、120、130 nmol/L時(shí)，檢測(cè)1 μg/L OTA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以相對(duì)吸光度值差值（A-A0）為考察對(duì)像（見(jiàn)圖3）：DNA2濃度為105 nmol/L時(shí)，（A-A0）最大，檢測(cè)效果最理想。所以，實(shí)驗(yàn)中DNA2包被濃度采用105 nmol/L。當(dāng)DNA1和DNA2用量一定時(shí)，對(duì)雜交溫度進(jìn)行優(yōu)化，考察了25、37℃和45℃下雜交對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果表明37℃時(shí)雜交效率最高，檢測(cè)結(jié)果最理想。洗滌緩沖液用文獻(xiàn)［13］報(bào)道的優(yōu)化的體系。

圖2 不同濃度DNA1包被酶標(biāo)板對(duì)吸光度值的影響Fig.2Influences of DNA1 concentration coating onto micro plate wells on absorbance change

圖3 不同濃度DNA2包被酶標(biāo)板對(duì)相對(duì)吸光度值的影響Fig.3Influences of DNA2 concentration coating onto micro plate wells on the relative absorbance value

封閉液的選擇：非特異性吸附引起的背景顏色較深，同時(shí)由于檢測(cè)限的定義與空白值的大小緊密相關(guān)，因此試圖通過(guò)封閉液的優(yōu)化來(lái)降低空白值。實(shí)驗(yàn)中考察了核酸適體在最優(yōu)包被量的條件下，BSA、明膠、乳粉、酪蛋白質(zhì)等封閉液對(duì)空白值的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)圖4）：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%乳粉做封閉液時(shí)，空白檢測(cè)值最?。ˋ450=0.154），因此選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%乳粉作為封閉液。

圖4 封閉液對(duì)空白測(cè)定值的影響Fig.4Influences of blocking solution on determination of blank value

2.3 檢測(cè)結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了此顯色體系對(duì)梯度稀釋的OTA的響應(yīng)。隨著OTA質(zhì)量濃度的增加，溶液顏色逐漸加深（見(jiàn)圖5（a），用裸眼觀察時(shí)，藍(lán)色產(chǎn)物比黃色產(chǎn)物更顯眼，所以圖5列出的是藍(lán)色顯色結(jié)果），450 nm處的紫外吸收值逐漸增大（見(jiàn)圖5（b），藍(lán)色產(chǎn)物加酸后，反應(yīng)被終止，藍(lán)色產(chǎn)物變成黃色，在450 nm處有最大吸收）。OTA與核酸適體序列發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致越來(lái)越多的dsDNA分解成單鏈，隨著OTA質(zhì)量濃度的增加，解離并被另一DNA捕獲的FITC-DNA越來(lái)越多，從而使溶液顏色加深，吸光度值增大。在1～100 μg/L范圍內(nèi)，450 nm紫外吸收變化值，即相對(duì)吸光度值差值（A-A0）與OTA質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖5（c），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

相關(guān)系數(shù)R2=0.995。檢出限（LOD）定義為空白加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的OTA質(zhì)量濃度，依據(jù)定義計(jì)算得該方法的LOD值為0.88 μg/L（空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.044）。該競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析法的靈敏度低于歐盟規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)，即能滿足歐盟的檢測(cè)要求。

圖5 TMB底物顯色體系對(duì)不同濃度OTA的顏色響應(yīng)、吸光度響應(yīng)及校正曲線（n=5）Fig.5Photograph of color，response of absorbance change at 450 nm and calibration curve（n=5）of TMB substrate system upon analyzing different concentrations of OTA

2.4 方法的特異性

選擇與OTA結(jié)構(gòu)類(lèi)似的物質(zhì)N-乙酰-L-苯丙氨酸和華法林及赭曲霉素B和黃曲霉素B1作交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合緩沖溶液作為陰性對(duì)照，用建立的競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適體分析法測(cè)定10、5、1 μg/L的OTA，結(jié)果見(jiàn)表2。在交叉反應(yīng)物質(zhì)量濃度高達(dá)10 μg/L時(shí)，P/N值仍然均小于2，即無(wú)交叉反應(yīng)發(fā)生，說(shuō)明所建立的檢測(cè)方法特異性良好。

表2 交叉反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2Experimental results of cross reaction

2.5 樣品的測(cè)定及添加回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)備兩份葡萄酒樣品，用作者建立的方法（ELAA）和購(gòu)買(mǎi)的ELISA試劑盒同時(shí)測(cè)定，確定OTA的本底值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果一致，表明該方法能應(yīng)用于實(shí)際樣品葡萄酒中OTA檢測(cè)，準(zhǔn)確性良好。

在兩份葡萄酒樣品中分別添加不同質(zhì)量濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品，在實(shí)驗(yàn)選定最佳條件下，進(jìn)行OTA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度，同時(shí)采用ELISA方法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（表3）顯示：ELAA法葡萄酒樣品中標(biāo)準(zhǔn)OTA回收率為92.03%～106.6%，添加回收的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.01%；且檢測(cè)結(jié)果與ELISA方法的一致。進(jìn)一步說(shuō)明作者所建立的方法能夠用于實(shí)際樣品葡萄酒中OTA的有效檢測(cè)。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)（n=5）Table 3Experiment results of recovery（n=5）

3 結(jié)語(yǔ)

以dsDNA作為識(shí)別核酸適體，建立了檢測(cè)OTA的競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)核酸適體分析方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，在1～100 μg/L范圍內(nèi)，相對(duì)吸光度值差值（A-A0）與OTA質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.88 μg/L。在實(shí)際樣品葡萄酒中添加適量的OTA后，添加回收率在92.03%～106.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于2.01%，該方法能用于葡萄酒中OTA含量的檢測(cè)，且方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)需樣品前處理，檢測(cè)時(shí)間短，可滿足大批量樣品和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等的要求。

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ZHAO Qiuling，LIU Lingling，YANG Lina.Novel aptamer-based enzyme-linked assay for the detection of ATP［J］.Chemical Journal of Chinese Universities，2014，35（6）:1161-1165.（in Chinese）

Enzyme-Linked Aptamer Assay for Detection of Ochratoxin A in Wine

ZHAO Qiuling1，SHI Suqing2
（1.College of Mining Industry Technology，Liaoning Technical University，Huludao 125105，China；2.College of Chemistry&Materials Science，Northwest University，Xi’an 710069，China）

ompetitive enzyme-linked aptamer assay for Ochratoxin A（OTA）detection in wine was investigated in this study.The binding of aptamer to the target OTA resulted in the dissociation of the DNA short chain from the aptamer，which was further captured by horseradish peroxidase（HRP）.HRP catalyzed 3，3'，5，5'.-Tetramethylbenzidine（TMB）substrate and finally leaded to a characteristic change that was detectable by the absorption of ultraviolet at 450 nm.The detection limit of OTA was determined by the linear relationship between OTA concentration and the absorbance.The factors influenced the effect of detection were investigated，including DNA concentration，temperature of hybridization，and blocking buffer solution.This work described the high performance of the competitive enzyme-linked aptamer assay（ELAA）for the determination of OTA.Under the optimal condition，the limit of detection attained was 0.88 μg/L and the linearity was in the range 1 to 100 μg/L.For the OTA detection in wine，the recovery rate was between 92.03%and 106.6%，and the relative standard deviation（RSD，n=5）was within 2.1%.This study validates the competitive ELAA is a useful tool for a rapid detection of OTA in wine.

ochratoxin A，competitive displacement，enzyme-linked aptamer assay，wine

O657.1

A

1673—1689（2015）04—0396—06

2014-11-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21004047）；陜西省青年科技新星人才項(xiàng)目（2014KJXX-62）。

趙秋伶（1979-），女，遼寧北鎮(zhèn)人，理學(xué)博士，講師，主要從事生物化學(xué)與食品安全研究。E-mail:flyzhql@iccas.ac.cn