鄧菁，張?zhí)鹛穑醯?，金海珠，王洪?/p>

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005）

利用外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)對(duì)中國(guó)人參和西洋參進(jìn)行分子鑒定

鄧菁，張?zhí)鹛?，王迪，金海珠，王洪?

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005）

人參和西洋參是我國(guó)兩種重要的中藥材。兩者雖然形態(tài)相似，但藥性差異較大。為了建立一種簡(jiǎn)單高效的中國(guó)人參和西洋參的分子鑒別方法，作者利用從核DNA的外轉(zhuǎn)錄間隔（ETS）發(fā)掘的人參和西洋參單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），分別設(shè)計(jì)了人參和西洋參的等位基因特異性引物，并利用多重PCR對(duì)人參和西洋參進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，作者建立的多重PCR體系可以有效地對(duì)人參、西洋參及兩者的混合品進(jìn)行鑒定。

人參；西洋參；外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；單核苷酸多態(tài)性

人參為多年生五加科草本植物（Panax ginseng）的根，是我國(guó)最重要的中藥材之一。2012年9月4日，衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)人工種植的人參為新資源食品，極大地推動(dòng)了人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。西洋參為五加科植物（Panax quinquefolius）的根，近年來(lái)在我國(guó)大量種植。兩者雖然形態(tài)相似，但藥性差異較大。人參性溫，補(bǔ)氣偏于助陽(yáng)；而西洋參性涼，補(bǔ)氣偏于養(yǎng)陰［1］。因此人參和西洋參的適用人群有異，混淆使用可能會(huì)適得其反。雖然目前市場(chǎng)上人參和西洋參價(jià)格差別不大，但由于西洋參總皂苷含量普遍高于人參［2］，因此用西洋參冒充人參作為產(chǎn)品原料的情況較為多見(jiàn)。因此，為了保證人參和西洋參在臨床上的正確使用，亟需建立一種對(duì)人參和西洋參進(jìn)行快速有效地鑒別方法。

近年來(lái)，針對(duì)人參和西洋參的鑒別，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了大量的研究工作。根據(jù)人參和西洋參分別所含有的特征皂苷Rf和24（R）—擬人參皂苷F11，高效液相色譜和質(zhì)譜被用于建立人參和西洋參的指紋圖譜［3］。但兩者的特征性成分含量均較低，而且滯留時(shí)間比較接近，并且皂苷的含量會(huì)受到外界環(huán)境及加工處理等因素的影響，很難用于人參和西洋參產(chǎn)品尤其是混合品的有效鑒定。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)也被廣泛用于人參和西洋參的鑒定。比如RAPD［4］、AFLP［5］、RFLP［6］、SCAR［7］、SSR［8］、SNP［9］等。但RAPD和ISSR的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性受實(shí)驗(yàn)條件的影響較大；RFLP和AFLP需要對(duì)DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，且對(duì)DNA的質(zhì)量要求較高。SSR雖然穩(wěn)定性高，但是由于兩者之間的DNA片段長(zhǎng)度差異太小，需要用聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染進(jìn)行檢測(cè)，操作較為繁瑣。目前對(duì)人參和西洋參的分子鑒定研究主要集中在內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和5.8S rDNA，但中國(guó)人參種質(zhì)資源非常豐富，部分農(nóng)家品種并不能利用該區(qū)間與西洋參區(qū)分開(kāi)來(lái)。ETS區(qū)位于26S rDNA和18S rDNA之間的基因間隔區(qū)（IGS）上［10］，有報(bào)道表明ETS序列的進(jìn)化速率比ITS序列要快［11］。本研究對(duì)人參核DNA的外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ETS）進(jìn)行了分析，并利用從中發(fā)掘的SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)了中國(guó)人參和西洋參的簡(jiǎn)單高效的鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料

選用了5種中國(guó)人參的農(nóng)家品種：大馬牙、二馬牙、邊條、長(zhǎng)脖、黃果。西洋參則選用市售和山東文登種植的西洋參。樣品由煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院李桂生教授進(jìn)行性狀鑒定，來(lái)源和產(chǎn)地見(jiàn)表1。

1.2 基因組DNA的提取

以人參和西洋參的根為原料，利用液氮在研缽粉碎成粉末后，利用植物基因組DNA提取試劑盒（FOREGENE），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 采用的樣品Table 1Samples used in this study

1.3 ETS區(qū)的序列比對(duì)及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank中人參和西洋參的ETS序列（HQ650811和HQ650812），利用Clustal Omega在線軟件進(jìn)行序列比對(duì)。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5設(shè)計(jì)人參的特異性引物PgF和西洋參的特異性引物AgF及反向引物ETSR。人參和西洋參特異性引物的3’末端人為引入錯(cuò)配堿基以保證引物的特異性。

1.4 人參和西洋參特異性引物退火溫度的確定

用人參和西洋參的特異性引物PgF和AgF分別對(duì)人參和西洋參進(jìn)行擴(kuò)增，PCR（Eppendorf Mastercycler）反應(yīng)體系為20μL，其中包括10 ng的模板DNA，0.5μmol/L ETSR，0.5μmol/L PgF或AgF，10μL 2X Premix DNA polymerase（Genotech）。PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min，循環(huán)過(guò)程為94℃30 s，退火溫度分別選擇60、62和64℃，時(shí)間為30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保溫結(jié)束反應(yīng)。取3μL反應(yīng)產(chǎn)物在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上電泳并在凝膠成像系統(tǒng)（上海精科實(shí)業(yè)，WFH-201B）下檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)條帶確定PgF和AgF用于多重PCR鑒定人參和西洋參的退火溫度。

1.5 人參和西洋參的PCR鑒定

PCR反應(yīng)體系為20μL，其中包括10 ng的模板DNA，0.5μmol/L ETSR，0.5μmol/L PgF，0.2μmol/L AgF，10μL 2X Premix DNA polymerase（Genotech）。PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min，循環(huán)過(guò)程為94℃30 s，64℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保溫結(jié)束反應(yīng)。取3μL反應(yīng)產(chǎn)物在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上電泳并在凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 人參和西洋參特異引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)人參和西洋參ETS區(qū)的比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在第55和第169的堿基位置上，人參都是T而西洋參都為A。根據(jù)這兩個(gè)突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)西洋參和人參的正向特異性引物AgF和PgF。為了保證引物的特異性，將AgF的倒數(shù)第二位堿基由A改為T(mén)（GTGTTGGCATAGTGTACGTTA），PgF的倒數(shù)第三位堿基由C變?yōu)锳（AGAGCAGTAAGCCTTGGAAA AT），使得特異性引物對(duì)非目標(biāo)DNA有兩個(gè)堿基的錯(cuò)配。同時(shí)設(shè)計(jì)引物ETSR（AGACAAGCATATGAC TACTGGCAGG）作為兩個(gè)特異性引物的反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。比對(duì)結(jié)果及引物的相對(duì)位置如圖1所示。

圖1 中國(guó)人參與西洋參的比對(duì)結(jié)果Figure 1Comparison of ETS sequences of Panax ginseng and Panax quinquefolius.

2.2 人參和西洋參特異性引物退火溫度的確定

用人參和西洋參的特異性引物分別對(duì)人參和西洋參進(jìn)行擴(kuò)增，如圖2所示，對(duì)于人參的特異性引物PgF，3個(gè)不同的退火溫度對(duì)人參的擴(kuò)增效率幾乎沒(méi)有影響，而西洋參在64℃時(shí)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。同樣，對(duì)于西洋參的特異性引物AgF，3個(gè)不同的溫度條件對(duì)西洋參的擴(kuò)增效率幾乎沒(méi)有影響，而人參在64℃時(shí)無(wú)擴(kuò)增條帶。

圖2 人參與西洋參特異引物的退火溫度檢測(cè)。Figure 2Determination of annealing temperatures of specific primers.

因此，用于鑒定人參和西洋參的退火溫度確定為64℃。

2.3 人參和西洋參的PCR鑒定

以中國(guó)人參的5個(gè)農(nóng)家品種和西洋參基因組DNA為模板，利用人參和西洋參的兩個(gè)正向特異性引物PgF和AgF及反向引物ETSR做多重PCR，引物的相對(duì)位置如圖3所示，反應(yīng)條件如1.5所述。

圖3 中國(guó)人參和西洋參鑒定的凝膠電泳圖譜。Figure 3Agarose gel image of authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius.

從凝膠成像結(jié)果可以看出，中國(guó)人參的5個(gè)農(nóng)家品種全部擴(kuò)增出388 bp的特異性條帶，兩個(gè)西洋參樣品擴(kuò)增出了501 bp的特異性條帶，對(duì)于人參和西洋參的混合品則兩種特異性條帶都有擴(kuò)增。在1.5所述的PCR條件下，對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了多次重復(fù)檢測(cè)，鑒定結(jié)果的重現(xiàn)性及可靠性均非常理想。因此，利用本研究的多重PCR體系可對(duì)人參、西洋參及兩者的混合品均能成功鑒定。

3 討論

與其他分子標(biāo)記相比，SNP分子標(biāo)記分布廣泛，遺傳穩(wěn)定，易于基因分型，非常適用于種間的快速鑒定。雖然有研究利用5.8S rDNA的SNP分子標(biāo)記對(duì)人參和西洋參進(jìn)行了鑒定，但中國(guó)人參種質(zhì)資源非常豐富，有大量的農(nóng)家品種作者發(fā)現(xiàn)并不能利用該區(qū)間與西洋參區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此，利用5.8S rDNA來(lái)區(qū)分人參和西洋參有局限性。

作者利用ETS區(qū)上人參和西洋參的SNP位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了人參和西洋參的特異性引物并利用多重PCR對(duì)人參和西洋參進(jìn)行了鑒定。為了保證引物的特異性，人為地在引物的3’末端引入了錯(cuò)配堿基。在適宜的退火溫度下，錯(cuò)配堿基的引入大大降低了非特異性擴(kuò)增的效率而對(duì)目標(biāo)DNA的擴(kuò)增效率幾乎沒(méi)有影響。作者建立的多重PCR體系可以在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)對(duì)人參、西洋參及兩者的混合品進(jìn)行鑒定，并且對(duì)模板DNA純度的要求不高，結(jié)果的檢測(cè)也只需要用瓊脂糖凝膠電泳即可完成。因此，本方法對(duì)現(xiàn)在的人參和西洋參進(jìn)行區(qū)別的化學(xué)分析法是一個(gè)有益的補(bǔ)充，并且可以作為中藥材及其混偽品進(jìn)行區(qū)分和鑒定的常規(guī)方法進(jìn)行應(yīng)用。

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Molecular Authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius by their Ribosomal DNA External Rranscribed Spacer Region

DENG Jing，ZHANG Tiantian，WANG Di，JIN Haizhu，WANG Hongtao*
（College of Life Science，Yantai University，Yantai 264005，China）

Panax ginseng and Panax quinquefolius are two important traditional Chinese medicine with similar morphology but different medicinal efficacy.This study aimed to develop a simple and effective analysis of molecular authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius.Two allelespecific primers of Panax ginseng and Panax quinquefolius were designed from their Single Nucleotide Polymorphism（SNP）created by ribosomal DNA（rDNA）external transcribed space（ETS）. Multiplex polymerase chain reaction（Multiplex PCR）was conducted for identification of Panax ginseng and Panax quinquefolius.The results confirmed the effective authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius as well as their mixture by the established PCR method.

Panax ginseng；，Panax quinquefolius，ETS，SNP

R282.5

A

1673—1689（2015）04—0420—04

2014-08-23

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013ZRCQ021）

*通訊作者：王洪濤（1982-），男，山東聊城人，理學(xué)博士，講師，主要從事中藥材DNA分子標(biāo)記研究。E-mail:wht1211@gmail.com