孔德昭，朱怡橙，馬偉，徐麗廣，胥傳來*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇淮安，223003）

西瓜花葉病毒三抗體夾心法與紙質免疫檢測傳感器檢測方法的建立

孔德昭1，朱怡橙2，馬偉1，徐麗廣1，胥傳來*1

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇淮安，223003）

利用西瓜花葉病毒2號外殼蛋白的小鼠單克隆抗體與兔多克隆抗體，建立兩種針對西瓜花葉病毒2號的檢測方法。運用現有的抗體建立了三抗體夾心酶聯免疫吸附法（TAS-ELISA）；運用碳納米管與抗體包裹濾紙制備紙質免疫檢測傳感器，再基于電化學工作站建立電化學紙質免疫檢測傳感器檢測方法。兩種方法對實際樣品檢測限分別為0.15、0.20 μg/mL，檢測時間分別為3 h和30 min。根據結果分析比較，三抗體夾心法具有較高的檢測靈敏度，而電化學紙質免疫傳感器檢測方法具有更短的檢測時間。

西瓜花葉病毒2號；外殼蛋白；三抗體夾心法；電化學紙質免疫檢測傳感器

西瓜花葉病毒2號（Watermelon mosaic viruses-2，WMV-2），一種重要的瓜類作物病毒，其侵染范圍主要包括葫蘆科、豆科植物，主要由病毒汁液摩擦接種傳播，也可由出桃蚜、棉蚜等進行非持久性傳毒，但也有非蚜傳株系，現今很多國家已經報道過西瓜花葉病毒對葫蘆科、豆科植物的危害［1］。

分子生物學技術檢測植物病毒具有靈敏度高的優(yōu)點，但是對檢測樣品的RNA抽提存在步驟繁瑣、容易污染等缺點，而且需要專門的檢測人員與檢測設備［2-3］。血清學方法檢測方法是傳統(tǒng)的植物病毒的檢測方法，其操作簡單，可以同時檢測大批量樣品，但是依賴于具有高度特異性和靈敏度的抗血清［4］。為了建立快速、簡便、靈敏的西瓜花葉病毒檢測方法，作者利用高效價、高特異性的西瓜花葉病毒2號外殼蛋白的抗體，分別基于ELISA技術與電化學分析方法技術建立了三抗體夾心法（TASELISA）與電化學紙質免疫傳感器檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WMV-2感染樣品（南瓜病葉）、WMV-2外殼蛋白小鼠單克隆抗體、WMV-2外殼蛋白兔多克隆抗體：中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所產品；明膠、3，3，5，5-四甲基聯苯胺（TMB）、聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）：Sigma公司產品；HRP-羊抗兔抗體：Jackson公司產品；短羧基化高純單壁碳納米管（TNSSC）：中國科學院成都有機化學有限公司產品；預染蛋白相對分子質量標準：生興生物技術有限公司產品；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司產品；高吸附性96孔酶標板：無錫國盛生物工程有限公司產品；FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)：上海復日科技有限公司產品；CHI760b電化學工作站：上海辰華儀器公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 西瓜花葉病毒外殼蛋白純化西瓜花葉病毒感染的南瓜病葉，加入2倍體積0.2 mol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH7.4，含體積分數1%巰基乙醇）勻漿，加入等體積氯仿，4℃攪拌30 min，充分乳化；乳化液9 000 r/min離心15 min，吸出上清水相，加入PEG6000和NaCl使其終質量分數分別為8%與4%，攪拌至溶解，4℃過夜；9 000 r/min離心25 min，棄去上清，沉淀用適量磷酸鈉緩沖液懸浮，用組織研磨器勻漿后抽提；9 000 r/min離心15 min，棄去沉淀；上清經質量分數20%蔗糖溶液40 000 r/min離心2 h，棄去上清；去離子水懸浮沉淀，勻漿抽提4～5遍；少量去離子水懸浮沉淀，9 000 r/min離心15 min，上清即為提純病毒外殼蛋白［5］。提純病毒外殼蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳表征。電泳使用5 g/dL濃縮膠，恒壓80 V 30 min，8 g/dL分離膠，恒壓120 V 120 min，固定液（25 g三氯乙酸+200 mL超純水）固定30 min，染色液（1 g考馬斯亮藍+100 mL固定液）染色5 min，脫色液（1 mL乙醇+1 mL乙酸+ 98 mL超純水）脫色4 h，使用FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行鑒定并計算相對分子質量。

1.3.2 TAS-ELISA方法的建立使用中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所提供的WMV-2外殼蛋白小鼠單克隆抗體為包被抗體，包被質量濃度為2 μg/mL，100 μl/孔，37℃孵育2 h，棄去液體，使用質量分數0.05%PBST溶液洗板3次，加入含0.2 g/dL明膠的CBS封閉溶液，200 μL/孔，37℃孵育2 h，重復洗板3次拍干。每孔加入100 μL不同質量濃度提純病毒外殼蛋白溶液（0.15～10 μg/mL）或不同稀釋度WMV-2感染病葉研磨液上清液，37℃孵育1 h，重復洗板3次，每孔加入100 μL 2 μg/mL WMV-2外殼蛋白兔多克隆抗體，37℃孵育1 h，重復洗板3次，每孔加入100 μL體積比1∶3 000稀釋的HRP-羊抗兔抗體，37℃避光孵育30 min，重復洗板4次，每孔加入100 μL TMB底物顯色液，37℃避光孵育15 min，每孔用50 μL 2 mol/L硫酸終止液終止，酶標儀檢測450 nm波長吸光度值［6-7］。

1.3.3 TAS-ELISA方法特異性檢測西瓜花葉病毒TAS-ELISA方法分別對不同稀釋比例WMV-2感染病葉研磨液上清、健康南瓜葉片研磨液上清、建蘭花葉病毒感染病葉研磨液上清、齒舌蘭環(huán)斑病毒感染病葉研磨液上清進行檢測。

1.3.4 電化學紙質免疫檢測傳感器的制備將聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）按1：6比例均勻分散于去離子水中，再將不同質量水溶性的羧基修飾的短臂碳納米管分散于PSS-水溶液中，超聲處理6 h使得碳納米管在PSS-水溶液中充分分散。充分分散的PSS-水溶液冷卻至室溫，加入WMV-2外殼蛋白兔多克隆抗體，抗體終質量濃度為15 μg/mL，震蕩均勻。將固定長寬度的濾紙（0.5 cm×6 cm）浸沒到抗體-碳納米管-PSS溶液中，浸泡10 min后取出，冷凍干燥。反復循環(huán)操作浸沒-干燥過程一定次數，將干燥后的紙電極4℃密封保存，即制得植物病毒紙質免疫檢測傳感器［8］。

1.3.5 電化學紙質免疫檢測傳感器檢測方法建立使用CHI 760B電化學工作站進行檢測實驗。實驗初始電壓為2 V、采樣間隔0.001 s，以所制得的WMV-2紙質免疫檢測傳感器為工作電極，Pt電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，pH7.4的0.1 mol/L PBS為緩沖溶液，在電化學工作站控制下，記錄隨著時間流經工作電極的電流，即i-t曲線；分別向緩沖溶液體系中加入不同體積WMV-2提純病毒外殼蛋白溶液，得到不同終濃度病毒外殼蛋白緩沖溶液（0.5～160 nmol/L），分別記錄每次檢測的i-t曲線；以每次記錄的i-t曲線的穩(wěn)定電流值為縱坐標，以所記錄的電流值所對應的WMV-2濃度為橫坐標，建立電流-WMV-2濃度標準曲線［9］。

2 結果與分析

2.1 西瓜花葉病毒外殼蛋白提純后表征

提純病毒分別稀釋兩個不同的濃度，與病毒感染南瓜病葉研磨液上清同時比對表征，提純后的病毒上清液與病葉研磨上清液相比顯示出一條明顯的蛋白條帶，經生物電泳圖像分析系統(tǒng)分析，其主要條帶相對分子質量約為3.24×104（圖1），與文獻報道基本相符［10］。

圖1 不同稀釋度提純后的病毒上清液與病葉研磨上清液電泳表征圖Fig.1Different dilution degrees of purified virus supernatant and disease leaves

2.2 TAS-ELISA方法

以西瓜花葉病毒外殼蛋白小鼠單克隆抗體與兔多克隆抗體分別作為包被抗體與捕獲抗體，以HRP-羊抗兔抗體作為檢測抗體，以提純西瓜花葉病毒外殼蛋白作為檢測標準品，建立的TAS-ELISA方法顯示出對西瓜花葉病毒外殼蛋白的良好的檢測結果。線性范圍達到0.156～10 μg/mL，相關系數R2為0.996，其回歸方程為y=0.16899x+0.19727，x為西瓜花葉病毒外殼蛋白濃度，y為450 nm吸光度值（圖2）。

圖2 TAS-ELISA方法檢測西瓜花葉病毒2號外殼蛋白標準曲線Fig.2The standard curve for WMV-2 coat protein in TAS-ELISA.

應用建立的TAS-ELISA方法對不同稀釋倍數病毒感染南瓜病葉研磨液上清進行檢測，結果顯示TAS-ELISA方法對不同稀釋倍數的實際感染病葉研磨液上清均有良好的檢出性，當病毒感染南瓜病葉研磨液上清稀釋倍數達到640倍時仍為陽性，表明檢測靈敏度可以達到1：640。應用建立的TASELISA方法分別檢測不同稀釋倍數的病毒感染南瓜病葉研磨液上清、健康南瓜葉片研磨液上清、建蘭花葉病毒感染病葉研磨液上清與齒舌蘭環(huán)斑病毒感染病葉研磨液上清，結果顯示建立的TAS-ELISA方法只對西瓜果葉病毒感染的南瓜病葉研磨液上清有陽性檢測結果，而對健康南瓜葉片研磨液上清、建蘭花葉病毒感染病葉研磨液上清與齒舌蘭環(huán)斑病毒感染病葉研磨液上清檢測結果均顯陰性，表明建立的TAS-ELISA方法對西瓜花葉病毒具有良好的特異性，而且對于實際樣品具有良好的檢測性。

2.3 電化學紙質免疫檢測傳感器

基于單壁碳納米管對于濾紙具有良好的粘附力，將羧基修飾的單臂碳納米管按一定濃度溶解分散在體積比1：6的PSS-去離子水溶液中，通過重復浸沒-冷凍干燥過程，將納米管層層包裹在固定長寬度（0.5 cm×6 cm）的濾紙表面，包裹層數即為重復浸沒-冷凍干燥的次數。隨包裹層數的增加，濾紙表面形態(tài)與顏色逐漸發(fā)生變化。

在碳納米管內，電子沿碳納米管軸向運動，表現出良好的導電性。使用CHI 760B電化學工作站為檢測儀器，初始電壓為2 V、采樣時間間隔0.001 s，工作電極為紙質免疫檢測傳感器，對電極為Pt電極，參比電極為飽和甘汞電極，緩沖溶液使用pH7.4的0.1 mol/L的PBS溶液，在確定的檢測條件下對不同包裹層數的紙質免疫檢測傳感器穩(wěn)定電流值進行檢測。可以明顯看出在低包裹次數條件下紙質免疫檢測傳感器穩(wěn)定電流值隨包裹層數的上升而上升，當包裹層數達到一定次數之后，紙質免疫檢測傳感器的穩(wěn)定電流值上升趨勢減緩。綜合考慮，選擇紙質免疫傳感器的包裹層數為12層，以取得較高的穩(wěn)定電流值與較快的制備速度。

在相同的包裹層數條件下，使用不同碳納米管終濃度的羧基修飾的單臂碳納米管-PSS-去離子水溶液對固定長寬度（0.5 cm×6.0 cm）的濾紙進行包裹，濾紙表面吸附的單壁碳納米管形態(tài)有著明顯的差異，對紙質免疫傳感器的導電性能有著顯著的影響。在低濃度碳納米管的包裹液條件下，紙質免疫檢測傳感器的穩(wěn)定電流值較低；隨著包裹液中碳納米管濃度的上升，紙質免疫檢測傳感器的穩(wěn)定電流值呈現上升趨勢，直至達到一個穩(wěn)定值；隨著包裹液中碳納米管濃度的進一步上升，紙質免疫檢測傳感器表面的碳納米管會出現起皺，脫落現象。綜合考慮，選擇碳納米管質量濃度為40 mg/mL的羧基修飾的單臂碳納米管-PSS-去離子水溶液對紙質免疫檢測傳感器進行包裹。

2.4 電化學檢測方法

配制碳納米管終濃度為40 mg/mL的羧基修飾的單臂碳納米管-PSS-去離子水溶液，室溫下加入終濃度為15 μg/m的WMV-2病毒兔多抗，對固定長寬度（0.5 cm×6.0 cm）的濾紙反復進行浸沒-冷凍干燥過程，共循環(huán)12次，制備得到電化學紙質免疫檢測傳感器。以添加不同濃度WMV-2提純病毒外殼蛋白溶液（終濃度0.5～160 nmol/L）的pH7.4的0.1 mol/L的PBS緩沖溶液作為標準品，使用建立的電化學紙質免疫檢測傳感器檢測方法分別檢測其i-t曲線的穩(wěn)定電流值。結果顯示隨著標準品溶液中WMV-2提純病毒外殼蛋白溶液濃度的上升，電化學紙質免疫檢測傳感器檢測方法檢測到的i-t曲線的穩(wěn)定電流值逐步下降。以每次檢測的穩(wěn)定電流值為縱坐標，以所記錄的電流值所對應的WMV-2外殼蛋白濃度為橫坐標，建立電流-WMV-2外殼蛋白濃度標準曲線，兩者之間成線性關系。線性范圍為0.25～20 μg/mL，相關系數R2為0.992 15，其回歸方程為y=3.032 76-0.054 25x，x為西瓜花葉病毒2號外殼蛋白質濃度，y為i-t曲線穩(wěn)定電流值（圖5）。表明所建立的電化學紙質免疫檢測傳感器檢測方法可以在一定的范圍內定量的檢測出樣品中所含有的WMV-2病毒外殼蛋白質的濃度。

圖3 電化學紙質免疫檢測傳感器檢測法檢測西瓜花葉病毒2號外殼蛋白Fig.3Paper supported immunosensor to detect the coat protein of watermelon Mosaic virus 2

3 結語

使用西瓜花葉病毒2號的高特異性、高靈敏度小鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體，基于ELISA檢測技術原理，建立針對西瓜花葉病毒2號外殼蛋白的高靈敏度TAS-ELISA檢測方法。在基于電化學分析方法的基礎上，將碳納米管材料與其相結合，利用免疫學原理，使用西瓜花葉病毒2號的高特異性、高靈敏度兔多克隆抗體建立起針對西瓜花葉病毒2號的電化學紙質免疫檢測傳感器的快速檢測方法。

所建立的兩種針對西瓜花葉病毒外殼蛋白的檢測方法對該病毒均具有很好的檢出效果。兩種方法相比較，所建立的TAS-ELISA方法具有更高的檢測靈敏度與很好的特異性等優(yōu)點；所建立的電化學紙質免疫檢測傳感器檢測方法具有更快的檢測速度、更便捷等優(yōu)點。所建立兩種檢測方法對西瓜花葉病毒的檢疫鑒定工作均具有良好的實際意義。

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TAS-ELISA and Electrochemical Paper Assisted Immunosensor for the Detection of Watermelon Mosaic Virus

KONG Dezhao1，ZHU Yicheng2，MA Wei1，XU Liguang1，XU Chuanlai*1
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Life Science and Chemical Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huaian 223003，China）

Using a mice monoclonal antibody and a rabbit polyclonal antibody of the watermelon mosaic virus（WMV）-2 coat protein，we developed two detection methods for WMV-2.The trimer antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（TAS-ELISA）method was established based on two different antibodies；the electrochemical paper assisted immunosensor detection method was established by combining the electrochemical workstation with the paper assisted immunosensor prepared by the carbon nanotube and the antibody-coated filter paper.The detection limit was 0.15 and 0.2 μg/ml，and the testing time was 3 hours and 30 minutes for two methods，respectively.According to these results，the TAS-ELISA method had a higher detection sensitivity，and the electrochemical paper assisted immunosensor detection method had a shorter testing time.

watermelon mosaic virus 2，coat protein，TAS-ELISA method，electrochemical paper assisted immunosensor

S432.41

A

1673—1689（2015）04—0367—05

2014-06-20

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAC01B07）。

孔德昭（1990-），男，安徽宣城人，食品科學與工程博士研究生，主要從事食品安全檢測研究。E-mail:kdz19900910@163.com

*通訊作者：胥傳來（1965-），男，江蘇鹽城人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品安全研究。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn