呂 波，張文政，李春雨，明 鳳

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200433；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433）

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一.MYB家族轉(zhuǎn)錄因子在C 端與DNA 結(jié)合域之間都具有一個(gè)富含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活功能域，根據(jù)所包含的MYB 結(jié)構(gòu)域的序列和數(shù)量，植物中MYB家族轉(zhuǎn)錄因子可以分為1R－MYB、3R－MYB、4R－MYB以及R2R3－MYB共4大類［1］.已在多種植物中發(fā)現(xiàn)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，水稻和擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有198個(gè)和183個(gè)MYB家族的成員［2］.

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各種植物體中，其具有非常廣譜的作用功能，如在參與植株形態(tài)建成以及花器官發(fā)育［3］和葉片形態(tài)的建成［4］；參與了植物次生代謝過程［5］，參與激素調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［6－7］，植物的防御反應(yīng)以及在非生物逆境中發(fā)揮作用［8］.大量的證據(jù)表明，在高溫［9］、低溫［10］、干旱［11］、高鹽［12］、氮缺失［13］等非生物脅迫應(yīng)答過程中，MYB轉(zhuǎn)錄因子也起著調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)生物防御反應(yīng)的功能.

擬南芥中的AtMYB84（又被稱為AtRAX3），其突變體最早在1998年就有報(bào)道［14］，但直到2006年Muller等［15］才發(fā)現(xiàn)當(dāng)AtMYB84基因與其他兩個(gè)基因AtMYB37（RAX1），AtMYB38（RAX2）共突變時(shí)才表現(xiàn)出對(duì)擬南芥?zhèn)壬稚M織發(fā)育的影響，因此將這三個(gè)基因命名為RAX（Regulators of Axillarymeristems）基因.

通常根據(jù)MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫過程中是否依賴脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑可將其分為兩類：一類是和ABA 信號(hào)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)子區(qū)域常含有ABRE 一致序列；另一類是獨(dú)立于ABA 信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子，其啟動(dòng)子中含有如CRT／DRE等核心元件［8］.

水稻是人類的主要糧食作物之一，優(yōu)良品種選育是提高水稻產(chǎn)量的主要方式之一.矮稈品種的選育和推廣是上世紀(jì)水稻育種的最主要成就之一.水稻的矮生性是指成熟期水稻植株高度較正常植株矮的遺傳特性.研究表明，這些矮稈或半矮稈水稻的產(chǎn)量一般比高桿品種要高20%～30%以上［16］.因此，矮稈基因的挖掘、鑒定和利用對(duì)于水稻增產(chǎn)的研究是有重要意義的.

植物生長(zhǎng)和發(fā)育受到多種環(huán)境因素的影響，其中，鹽脅迫是環(huán)境脅迫中影響植物生長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)性狀的最主要因素之一.現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，土壤鹽漬化、海水倒灌等因素影響著水稻耕地面積，約有20%的世界耕地面積受到鹽堿化的影響［17］.Liu等［18］研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)水通道蛋白基因OsPIP1；1過表達(dá)可以提高水稻對(duì)高鹽脅迫的抗性、根系導(dǎo)水率以及種子產(chǎn)量.因此，研究高鹽抗性基因，對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)理的探討和提升農(nóng)業(yè)性狀有重要意義.

水稻中MYB84同源基因的分離以及功能研究還未見報(bào)道，因此本研究通過克隆OsMYB84基因，以轉(zhuǎn)基因日本晴水稻為材料，研究OsMYB84轉(zhuǎn)基因水稻正常生長(zhǎng)表型以及在高鹽脅迫下的表型，為探索水稻矮稈，抗逆性狀基因以及其作用機(jī)制提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

水稻日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare）在培養(yǎng)箱（GXZ－380D，Ningbo，China）中培養(yǎng)，生長(zhǎng)條件為光周期16 h／8 h（Light／Dark），28 ℃.根癌農(nóng)桿菌菌株Agrobacterium tumefaciens EHA105，E.coli DH5α均購自TaKaRa公司.pSPT19載體購自Roche，pCR－Blunt、pCAMBIA－1304（含CaMV35S組成型啟動(dòng)子）、pC35S：GFP均由本實(shí)驗(yàn)室保存.PCR 引物、限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純.水稻培養(yǎng)液配方參照Yoshida等［19］的方法.

1.2 方法

1.2.1 水稻OsMYB84基因的獲得

用TRIzol提取水稻野生型植株的總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA 第一條鏈，目的基因OsMYB84 PCR 引物見表1，利用此引物克隆OsMYB84的克隆全長(zhǎng)OsMYB84，共1 209bp，回收PCR 產(chǎn)物構(gòu)建到pCRBlunt載體中；利用引物OsMYB84Enyzme和pCRBlunt－OsMYB84克隆全長(zhǎng)OsMYB84并加入酶切位點(diǎn)BglⅡ和SpeⅠ，回收PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，得到含有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的基因片段，將其連入同樣雙酶切的pCAMBIA1304載體中，構(gòu)建好的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105.PCR 的程序?yàn)椋?4℃4min；94℃40s，50℃40s，68℃90s；68℃10min，35個(gè)循環(huán).

1.2.2 OsMYB84的序列比對(duì)和聚類分析

根據(jù)OsMYB84的DNA 序列，通過NCBI數(shù)據(jù)推測(cè)出相應(yīng)的氨基酸序列，在數(shù)據(jù)庫中檢索不同物種中R2R3－MYB亞家族的同源基因，用Clustal X 軟件進(jìn)行同源基因的序列比對(duì)，通過Neighbour－joining法對(duì)這些基因進(jìn)行進(jìn)化分析，并利用MEGA4軟件繪制了進(jìn)化樹.

1.2.3 亞細(xì)胞定位

采用GFP標(biāo)簽技術(shù)，通過BglⅡ和SpeⅠ雙酶切得到的目的基因片段連入植物表達(dá)載體pC35S：GFP中，構(gòu)建OsMYB84與GFP融合蛋白表達(dá)載體，通過基因槍轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，研究目的蛋白OsMYB84的亞細(xì)胞定位.

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

將已構(gòu)建的包含35S：OsMYB84過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1304－OsMYB84，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻.以農(nóng)桿菌菌株EHA105為載體，侵染誘導(dǎo)的日本晴水稻愈傷組織，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選、誘導(dǎo)分化和生根，獲得轉(zhuǎn)基因苗，得到的子代經(jīng)育種篩選獲得轉(zhuǎn)基因水稻純合體.

1.2.5 OsMYB84在水稻不同器官中的表達(dá)譜

用TRIzol提取水稻不同發(fā)育時(shí)期的葉片以及根、莖與花序的總RNA，并用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa）分解混入的DNA 并發(fā)轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect RealTime）（TaKaRa Code：DRR081）進(jìn)行qRT－PCR 反應(yīng)檢測(cè)OsMYB84的mRNA 水平.目的基因OsMYB84和內(nèi)參基因OsACTIN 的qRT－PCR 引物見表1.Real－Time PCR 程序?yàn)?5 ℃3 min；94℃10s，55℃20s，40個(gè)循環(huán).

1.2.6 OsMYB84在不同激素和逆境脅迫處理下的表達(dá)譜

以野生型水稻發(fā)芽后兩周，分別選用10%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和低溫4 ℃處理1～4d；200μmol／L NaCl、100μmol／L 茉莉酸（jasmonate，JA）處理1d；10μmol／L 激動(dòng)素（kinetin，KT）、10μmol／L細(xì) 胞 分 裂 素（6－benzyladenine，6－BA）、10 μmol／L 生 長(zhǎng) 素（indoleacetic acid，IAA）、5μmol／L赤霉素（gibberellin，GA）處理1d；50μmol／L 脫落酸（abscisic acid，ABA）處理2～24h，按照1.2.5的方法檢測(cè)OsMYB84的表達(dá)量.

1.2.7 原位雜交

選取OsMYB84mRNA 的308bp的高特異性片段為探針，以克隆的OsMYB84片段為模板，設(shè)計(jì)原味雜交探針引物（表1），回收PCR 片段，EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后連入同樣雙酶切的pSPT19載體.探針制備方法參照Roche DIG RNA labeling Kit（SP6／T7）.選取水稻根、芽以及不同發(fā)育時(shí)期的花，4%多聚甲醛固定，參照Wang等［20］方法進(jìn)行脫水包埋、切片、雜交.

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的RNA 表達(dá)水平鑒定

以兩周齡的水稻葉片為材料，按照1.2.5的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)量.

1.2.9 轉(zhuǎn)基因植株苗期耐鹽性鑒定

將OsMYB84過表達(dá)株系和野生型催芽后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中正常生長(zhǎng)兩周，兩周后轉(zhuǎn)移至添加200mmol／L NaCl（參照文獻(xiàn)［10］）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)；15h后取部分植株測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系與野生型在兩種培養(yǎng)條件下的葉片的電導(dǎo)率（電導(dǎo)率儀：雷磁DDS－307），剩余植株恢復(fù)培養(yǎng)；恢復(fù)培養(yǎng)2d后測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的莖、根以及整株鮮重，并與對(duì)照組比較取相對(duì)值為相對(duì)莖鮮重（Relative Shoot Weight，RSW）、相對(duì)根鮮重（Relative Root Weight，RRW）以及相對(duì)整株鮮重（Relative Fresh Weight，RFW）.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物＊Tab.1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 OsMYB84基因的克隆、序列分析和亞細(xì)胞定位

通過對(duì)應(yīng)的擬南芥的AtMYB84進(jìn)行生物信息學(xué)分析與基因文庫中比對(duì)與搜索，克隆水稻中與擬南芥的AtMYB84 最為相似的基因（80%相似性），命名為OsMYB84（NM＿001057941.1），該基因全長(zhǎng)1 209bp，開放閱讀框?yàn)?66bp，編碼321 個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量35.35ku.同源序列比對(duì)分析表明OsMYB84基因含有R2和R3保守的3個(gè)色氨酸區(qū)域（圖1（a）），屬于R2R3－MYB家族.

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的不同物種R2R3－MYB 家族成員序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)OsMYB84與其他MYB家族基因一樣具有保守的R2R3結(jié)構(gòu)域，聚類分析顯示OsMYB84除了與AtMYB84基因關(guān)系較近外，還與GmMYB161、AtRAX2、AtMYB37、AtMYB96 等基因關(guān)系也相近（圖1（b）），其中，AtMYB84、AtRAX2、AtMYB37參與擬南芥?zhèn)壬稚M織的起始［15］，而AtMYB96 參與擬南芥在干旱［21－23］和冷脅迫［21］下的響應(yīng)，所以推測(cè)OsMYB84與這些基因功能最為相近.

根據(jù)全長(zhǎng)cDNA 推測(cè)的OsMYB84蛋白，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)含有潛在的核定位信號(hào).為了研究OsMYB84蛋白的亞細(xì)胞定位，將去掉終止密碼子的OsMYB84編碼框鏈接在綠色熒光蛋白GFP的N端，構(gòu)建pOsMYB84－GFP融合蛋白表達(dá)載體，在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá).在僅轉(zhuǎn)化GFP的對(duì)照洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光均勻分布在整個(gè)細(xì)胞中（圖1（c）1～3）；而融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光集中分布在細(xì)胞核中（圖1（c）4～6）.這些結(jié)果說明OsMYB84蛋白屬于核定位蛋白.

2.2 OsMYB84在水稻不同器官中以及不同激素和逆境脅迫處理下的表達(dá)模式分析

為了解OsMYB84基因在水稻不同器官中的表達(dá)定位，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的葉片以及其他器官如根、莖與花序取樣，進(jìn)行Real－Time RNA 水平分析.結(jié)果表明OsMYB84基因?yàn)榻M成型表達(dá)（圖2（a）），但在各器官之間表達(dá)量有很大差異：在莖中表達(dá)量最高，莖、幼葉、成熟葉、老葉之間的表達(dá)量沒有明顯差異，根中表達(dá)量相對(duì)較少，花中表達(dá)量最少.

圖1 （a）OsMYB84基因序列比對(duì)，（b）進(jìn)化分析和（c）亞細(xì)胞定位Fig.1 （a）Amino acids sequence alignment，（b）phylogenetic analysis and（c）subcellular localization of OsMYB84

為了解OsMYB84基因?qū)Ψ巧锩{迫和外源植物激素處理的表達(dá)特性，對(duì)野生型日本晴水稻發(fā)芽后14d的幼苗進(jìn)行了生長(zhǎng)素（IAA）、激動(dòng)素（KT）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（6－BA）、聚乙二醇（PEG）、高鹽以及低溫等處理.利用Real－Time PCR 的方法檢測(cè)不同激素和脅迫處理下OsMYB84表達(dá)量的變化.在ABA 處理6h后，OsMYB84表達(dá)水平迅速提高，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量隨之上升，到12h表達(dá)量達(dá)到最大值，而到24h時(shí)，OsMYB84表達(dá)量與對(duì)照并沒有顯著差異（圖2（b，c））.此外，OsMYB84的表達(dá)還受到6－BA、PEG、NaCl誘導(dǎo).PEG 模擬干旱處理1d時(shí)OsMYB84表達(dá)量與對(duì)照組相比并沒有顯著差異，到4d時(shí)表達(dá)水平變高；鹽脅迫處理1d時(shí)OsMYB84就開始表達(dá)，到4d時(shí)與對(duì)照組差異更顯著（圖2（d））.上述研究結(jié)果表明，OsMYB84基因受到ABA、高鹽脅迫誘導(dǎo)高表達(dá)，也受到干旱誘導(dǎo)的微弱表達(dá)，暗示著OsMYB84在應(yīng)答高鹽、干旱脅迫時(shí)可能是依賴于ABA 途徑.

圖2 OsMYB84在水稻（a）不同器官、（b）不同激素、（c）激素ABA 不同時(shí)間段和（d）逆境脅迫處理下的表達(dá)模式Fig.2 The OsMYB84expression pattern（a）in various organs of rice，（b）under different hormones treatment，（c）ABA treatment over different times，（d）different abiotic stresses

2.3 OsMYB84基因組織水平的表達(dá)模式分析

因器官表達(dá)譜（圖2（a））說明OsMYB84表達(dá)的遍在特性，為進(jìn)一步確定目標(biāo)基因在不同組織器官中的具體定位，通過序列同源性分析，設(shè)計(jì)OsMYB84高特異片段為原位探針，對(duì)水稻不同花發(fā)育時(shí)期、根、芽進(jìn)行了原位雜交.結(jié)果顯示OsMYB84在穎花原基（圖3（a，b））、小穗（圖3（c，d））、藥室（圖3（e，f））與花粉（圖3（h））中高度表達(dá)，這些結(jié)果暗示OsMYB84可能參與花粉發(fā)育.同時(shí)，該基因在葉基部葉枕（圖3（i））和根原基高表達(dá)（圖3（j）），也預(yù)示著OsMYB84可能參與細(xì)胞分裂分化.

圖3 OsMYB84在不同組織的原位分析Fig.3 In situ hybridization analysis of OsMYB84in various tissues

2.4 過表達(dá)OsMYB84基因的水稻株系株高變矮

由于OsMYB84基因在不同器官中的表達(dá)差異，為深入了解OsMYB84 基因?qū)λ景l(fā)育的影響，將OsMYB84基因的編碼框連入pCAMBIA1304載體，使之在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá).利用real－time PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻純合體株系中的OsMYB84的表達(dá)水平（圖4（a）），結(jié)果顯示OX1、OX3、OX4轉(zhuǎn)基因株系中目的基因表達(dá)量高于野生型（WT）.通過對(duì)28℃光照16h／黑暗8h培養(yǎng)兩周齡的轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型（WT）的株高分析測(cè)量（圖4（b，c）），結(jié)果表明正常培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)基因水稻株高要明顯比野生型矮.

圖4 OsMYB84轉(zhuǎn)基因水稻的（a）RNA 水平鑒定，（b）株高表型及（c）株高分析Fig.4 （a）RNA level identification，（b）the height phenotype and（c）measurement of wild type and OsMYB84transgenic rice

2.5 過表達(dá)OsMYB84基因的水稻提高了對(duì)高鹽脅迫的耐性

因OsMYB84受到高鹽誘導(dǎo)，推測(cè)其參與高鹽脅迫下的水稻逆境的應(yīng)答反應(yīng)，在逆境應(yīng)答中起重要的調(diào)控作用.因此，通過對(duì)正常培養(yǎng)兩周齡的轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型植株分別放至正常培養(yǎng)液以及添加200mmol／L NaCl的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，正常培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)基因和野生型水稻葉片都沒有發(fā)生變黃卷曲現(xiàn)象，而NaCl處理的野生型水稻葉片相較于轉(zhuǎn)基因水稻卷曲黃化更明顯，這種黃化現(xiàn)象在恢復(fù)培養(yǎng)后越加明顯（圖5（a））.

圖5 OsMYB84轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型水稻幼苗的高鹽抗性Fig.5 High salinity tolerance of wild type and OsMYB84transgenic rice OX1at the vegetative stage

鹽處理15h后測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系與野生型在兩種培養(yǎng)條件下的葉片的電導(dǎo)率（圖5（b）），轉(zhuǎn)基因株系的電導(dǎo)率顯著低于野生型.并將NaCl處理的幼苗用正常培養(yǎng)液恢復(fù)培養(yǎng)，恢復(fù)培養(yǎng)2d后，測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的莖、根以及整株鮮重，并與對(duì)照組比較取相對(duì)值（圖5（c）），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻相對(duì)莖鮮重顯著高于野生型，表明OsMYB84 轉(zhuǎn)基因植株受高濃度鹽脅迫的損傷比野生型小.這些結(jié)果說明OsMYB84過表達(dá)能夠顯著提高苗期水稻對(duì)高鹽脅迫的耐受能力.

2.6 過表達(dá)OsMYB84基因的水稻對(duì)激素ABA表現(xiàn)敏感

由于OsMYB84受到激素ABA 誘導(dǎo)高表達(dá)，推測(cè)其影響了水稻對(duì)激素ABA 的敏感性.因此，對(duì)萌發(fā)期轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了ABA 處理實(shí)驗(yàn)，以正常MS培養(yǎng)基為對(duì)照，選取3μmol／L ABA 為添加處理激素，檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因水稻在ABA 處理下的發(fā)芽情況（圖6（a）），并測(cè)定每天的發(fā)芽率（圖6（c））.在添加ABA 培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因水稻的種子萌發(fā)受到顯著抑制，而無論是否添加ABA，野生型種子的萌發(fā)卻無明顯抑制現(xiàn)象.同時(shí)分析了水稻發(fā)芽8d后的生長(zhǎng)勢(shì)情況（圖6（b，d）），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)受到ABA 抑制，相對(duì)株高顯著低于野生型（圖6（a，b，d））.這些結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)ABA 更敏感.

圖6 OsMYB84轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型水稻在3μmol／L ABA 處理下的種子萌發(fā)情況Fig.6 Seed germination of wild type and OsMYB84transgenic rice OX1under treatment of 3μmol／L ABA

3 討論

3.1 OsMYB84屬于R2R3－MYB亞家族，定位于細(xì)胞核內(nèi)

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子包含很多基因，功能廣泛，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)過程.本研究從水稻中克隆了一個(gè)與擬南芥AtMYB84（At3g49690）高度同源的新基因OsMYB84（Os03g0771100），通過同源比對(duì)該基因具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，R2 和R3，得出OsMYB84 屬于R2R3－MYB 亞家族.聚類分析顯示OsMYB84與GmMYB84、AtMYB84同源性最高.亞細(xì)胞定位結(jié)果表明OsMYB84屬于核定位蛋白.

3.2 OsMYB84可能通過ABA 信號(hào)通路參與水稻耐鹽響應(yīng)

根據(jù)Nakashima等的研究，當(dāng)植物受到高鹽等滲透脅迫時(shí)，除了啟動(dòng)CBF 和DREB 類調(diào)節(jié)子的表達(dá)，還會(huì)啟動(dòng)表達(dá)多種激素ABA 合成基因，如ZEP、NCED 等，從而大量積累ABA，并且通過含有ABA響應(yīng)元件ABRE的調(diào)節(jié)因子啟動(dòng)下游基因表達(dá)［25］.而MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫過程中根據(jù)是否依賴ABA 信號(hào)途徑可將其分為依賴于ABA 和獨(dú)立于ABA 信號(hào)通路兩類［8］.OsMYB84脅迫和激素表達(dá)譜分析結(jié)果表明，OsMYB84受到NaCl和ABA 的顯著誘導(dǎo).200mmol／L NaCl苗期處理和3μM ABA 萌發(fā)實(shí)驗(yàn)分別說明OsMYB84 參與了水稻耐鹽響應(yīng)以及ABA 信號(hào)通路.另外，我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站（http：∥www.dna.affrc.go.jp／PLACE／）預(yù)測(cè)OsMYB84基因啟動(dòng)中的順式元件，發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子中含有一個(gè)ABA 響應(yīng)元件ABRELATERD1.因此，我們推測(cè)OsMYB84可能通過ABA 信號(hào)通路參與水稻耐鹽響應(yīng).

3.3 OsMYB84基因其他功能的探索

葉枕是在禾本科植物中，在葉片、葉鞘連接處的外側(cè)，具有決定葉傾角發(fā)育，影響水稻株高的功能［24］.擬南芥中與OsMYB84最為同源的基因AtMYB84基因，當(dāng)其與其他兩個(gè)基因AtMYB37、AtMYB38共突變時(shí)葉腋發(fā)育受到抑制［15］，也與側(cè)枝發(fā)育相關(guān).OsMYB84器官表達(dá)譜結(jié)果表明OsMYB84在水稻葉片和根部高表達(dá)，原味雜交結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證OsMYB84在葉片葉枕部位高表達(dá).同時(shí)，我們?cè)讷@得OsMYB84轉(zhuǎn)基因水稻的基礎(chǔ)上，比較了OsMYB84過表達(dá)與野生型水稻的株高表型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)水稻的株高要明顯比野生型矮.這些結(jié)果說明OsMYB84參與了水稻生長(zhǎng)，且有可能與葉枕發(fā)育有關(guān).但是，OsMYB84參與株高發(fā)育的具體機(jī)制，尚需更多的實(shí)驗(yàn)探索.

根系生長(zhǎng)是多種植物激素，如生長(zhǎng)素IAA、細(xì)胞分裂素CK 等調(diào)控的結(jié)果［26］.在根系發(fā)育中，細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)并抑制側(cè)根和冠根的起始［27］.OsMYB84 激素表達(dá)譜分析結(jié)果表明，OsMYB84受到6－BA 的誘導(dǎo)，同時(shí)器官表達(dá)譜和原味雜交的結(jié)果表明此基因在根系中高表達(dá)，這些結(jié)果說明OsMYB84基因極有可能參與了水稻根系發(fā)育，而且與細(xì)胞分裂素有關(guān).

根據(jù)Preston等的研究結(jié)果，MYB家族成員AtMYB32調(diào)控?cái)M南芥花粉的正常發(fā)育［28］；Baumann等也發(fā)現(xiàn)AtMYB16可以調(diào)控細(xì)胞和花瓣形態(tài)的建成［29］.OsMYB84器官表達(dá)譜和原位雜交結(jié)果表明，此基因在小穗、藥室與花粉中高度表達(dá)，說明OsMYB84也有可能參與了花器官形態(tài)建成和花粉發(fā)育過程，但具體的功能以及調(diào)控機(jī)制尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

［1］Dubos C，Stracke R，Grotewold E，et al.MYB transcription factors in Arabidopsis［J］.Trends in Plant Science，2010，15（10）：573－581.

［2］Yanhui C，Xiaoyuan Y，Kun H，et al.The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis：Expression analysis andphylogenetic comparison with the rice MYB family［J］.Plant Mol Biol，2006，60（1）：107－124.

［3］Yan X Y，Li J G，Pei M，et al.Over－expression of a flower－specific transcription factor gene AtMYB24 causes aberrant anther development［J］.Plant Cell Reports，2007，26（2）：219－228.

［4］Singh K B，F(xiàn)oley R C，Onate－Sanchez L.Transcription factors in plant defense and stress responses［J］.Current Opinion In Plant Biology，2002，5（5）：430－436.

［5］Yamagishi M，Shimoyamada Y，Nakatsuka T，et al.Two R2R3－MYBgenes，homologs of petunia AN2，regulate anthocyanin biosyntheses in flower tepals，tepal spots and leaves of Asiatic Hybrid Lily［J］.Plant and Cell Physiology，2010，51（3）：463－474.

［6］Abe H，Urao T，Ito T，et al.Arabidopsis AtMYC2（bHLH）and AtMYB2（MYB）function as transcriptional activators in abscisic acid signaling［J］.Plant Cell，2003，15（1）：63－78.

［7］Raffaele S，Rivas S，Roby D.An essential role for salicylic acid in AtMYB30－mediated control of the hypersensitive cell death program in Arabidopsis［J］.FEBS Letters，2006，580（14）：3498－3504.

［8］劉 蕾，杜 海，唐曉鳳，等.MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫中的作用及其分子機(jī)理［J］.遺傳，2008，30（10）：1265－1271.

［9］Feng C P，Andreasson E，Maslak A，et al.Arabidopsis MYB68in development and responses to environmental cues［J］.Plant Science，2004，167（5）：1099－1107.

［10］Liao Y，Zou H F，Wang H W，et al.Soybean GmMYB76，GmMYB92，and GmMYB177genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants［J］.Cell Research，2008，18（10）：1047－1060.

［11］Cominelli E，Galbiati M，Vavasseur A，et al.A guard－cell－specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance［J］.Current Biology，2005，15（13）：1196－1200.

［12］Dai X Y，Xu Y Y，Ma Q B，et al.Overexpression of an R1R2R3 MYB gene，OsMYB3R－2，increases tolerance to freezing，drought，and salt stress in transgenic Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2007，143（4）：1739－1751.

［13］Lea U S，Slimestad R，Smedvig P，et al.Nitrogen deficiency enhances expression of specific MYB and bHLH transcription factors and accumulation of end products in the flavonoid pathway［J］.Planta，2007，225（5）：1245－1253.

［14］Wisman E，Cardon G H，F(xiàn)ransz P，et al.The behaviour of the autonomous maize transposable element En／Spm in Arabidopsis thaliana allows efficient mutagenesis［J］.Plant Mol Biol，1998，37（6）：989－999.

［15］Muller D，Schmitz G，Theres K.Blind homologous R2R3 Myb genes control the pattern of lateral meristem initiation in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2006，18（3）：586－597.

［16］ACTZC.Semidwarf in rice germplasm collections and their potentials in rice improvement［J］.Phytibreedon，1985，1（1）：1－9.

［17］Zhu J.Plant salt tolerance［J］.Trends Plant Science，2001，6（2）：66－71.

［18］Liu C W，F(xiàn)ukumoto T，Matsumoto T，et al.Aquaporin OsPIP1；1promotes rice saltresistance and seed germination［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2013，63：151－158.

［19］Yoshida S D A F.Routine procedure for growing rice plants in culture solution［M］.Laboratory manual for physiological studies of rice.3rded.Los Banos，Laguna，Philippines：The International Rice Research Institute，1976：61－66.

［20］Wang J，Ming F，Pittman J，et al.Characterization of a rice（Oryza sativa L.）gene encoding a temperature－dependent chloroplastω－3fatty acid desaturase［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，340（4）：1209－1216.

［21］Guo L，Yang H，Zhang X，et al.Lipid transfer protein 3as a target of MYB96 mediates freezing and drought stress in Arabidopsis［J］.J Exp Bot，2013，64（6）：1755－1767.

［22］Seo P J，Xiang F，Qiao M，et al.The MYB96transcription factor mediates abscisic acid signaling during drought stress response in Arabidopsis［J］.Plant Physiol，2009，151（1）：275－289.

［23］Seo P J，Lee S B，Suh M C，et al.The MYB96transcription factor regulates cuticular wax biosynthesis under drought conditions in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2011，23（3）：1138－1152.

［24］張所兵，張?jiān)戚x，林 靜，等.水稻無葉枕突變體oslg－h(huán) 鑒定及基因定位［J］.分子植物育種，2014，12（1）：37－42.

［25］Nakashima K，Ito Y，Yamaguchi－Shinozaki K.Transcriptiona lregulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses［J］.Plant Physiology，2009，149（1）：88－95.

［26］Coudert Y，Périn C，Courtois B，et al.Genetic control of root development in rice，the model cereal［J］.Trends in Plant Science，2010，15（4）：219－226.

［27］E Z，Ge L，Wang L.Molecular mechanism of adventitious root formation in rice［J］.Plant Growth Regulation，2012，68（3）：325－331.

［28］Preston J，Wheeler J，Heazlewood J，et al.AtMYB32is required for normal pollen development in Arabidopsis thaliana［J］.The Plant Journal，2004，40（6）：979－995.

［29］Baumann K，Perez－Rodriguez M，Bradley D，et al.Control of cell and petal morphogenesis by R2R3 MYB transcription factors［J］.Development，2007，134（9）：1691－1701.