牛坤，秦海彬，柳志強，鄭裕國

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310014)

隨著煤炭石油等不可再生資源的日益減少，潛力巨大的燃油生物煉制技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注，其中，生物柴油產(chǎn)業(yè)更是在近幾年內(nèi)迅速發(fā)展。然而，每生產(chǎn)10 t生物柴油就會產(chǎn)生1 t甘油［1］，隨著全球各國生物柴油產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，必將對國際甘油市場形成極大的沖擊。為了解決這一問題，業(yè)界興起了以甘油為原料生產(chǎn)高附加值化學品的熱潮。

甘油具有特殊的物理性質(zhì)和化學結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及工業(yè)化工產(chǎn)品等領(lǐng)域［2］。而研發(fā)甘油的革新用途，建立其下游化學品開發(fā)利用的有效途徑，也成為近年來科學家不斷探索的新問題，當前利用甘油的有效途徑包括:生產(chǎn)乙醇、制備1，3-丙二醇、合成環(huán)氧氯丙烷、生產(chǎn)乙二醇、生產(chǎn)乳酸、合成二羥基丙酮及3-羥基丙酸等［3］。

3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是一種無色無味的油狀液體，可與水、醇、醚等多種溶劑互溶。3-HP為三碳無手性有機化合物，具有羧基和羥基兩種官能團，這使得3-HP具有優(yōu)良的化學性質(zhì)，如脫水生成丙烯酸，氧化生成有機酸等。同時3-HP也是一種重要的化學中間體，可以用來合成很多重要的工業(yè)化工產(chǎn)品，如涂料、膠黏劑、水處理化學品和個人護理用品等。由于3-HP顯著的市場價值及工業(yè)應(yīng)用前景，2004年美國能源部報告將3-HP列為當今世界上12種最具有開發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一［4］。

1 以甘油為底物合成3-HP的主要途徑及關(guān)鍵酶

目前，市售的3-HP均由化學合成法制得［5－6］。具體方法包括:由β-羥基丙腈與NaCN水解反應(yīng)制備3-HP;丙烯酸在高溫或液酸催化下生成3-HP;金屬鉑催化3-羥基丙醛生成3-HP等。但是，以上途徑中原材料多為非可再生資源，且易造成環(huán)境不兼容、成本高、產(chǎn)品分離純化復雜等問題，因此依靠上述途徑進行3-HP的大規(guī)模生產(chǎn)存在一定的局限性。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，生物法替代化學法合成大宗化學品已經(jīng)得到廣泛的研究，在此基礎(chǔ)上，研究學者嘗試采用生物法合成3-HP。目前生物法合成3-HP主要有兩種途徑，一是以葡萄糖為底物;二是以甘油為底物。甘油在微生物體內(nèi)可以通過氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)2種方式進行代謝。如圖1所示，在氧化途徑中，甘油首先經(jīng)過甘油脫氫酶 (GDH)催化生成二羥基丙酮(DHA)，然后進一步代謝生成磷酸二羥丙酮(DHAP)，最終進入糖酵解途徑生成丙酮酸，并為菌體的生長提供所需要的能量ATP和還原力NAD(P)H。在還原途徑中，甘油首先經(jīng)過甘油脫水酶(DhaB)與輔酶 VB12的作用，脫水生成3-羥基丙醛(3-HPA)，再由 1，3-丙二醇氧化還原酶 (DhaT/YqhD)還原為產(chǎn)物1，3-丙二醇 (1，3-PDO)，同時消耗了氧化途徑中所生成的NAD(P)H。而在甘油還原生成3-HPA后，可進一步在醛脫氫酶 (AldH)的催化下以NAD+為輔因子生成3-HP。

甘油脫水酶(DhaB)是生物合成3-HP的第一個關(guān)鍵酶。該酶為輔酶VB12依賴型，在厭氧或微氧條件下具有較高的活性。醛脫氫酶(AldH)是影響3-HP合成的第二個關(guān)鍵酶，該酶為輔酶NAD+依賴型，在氧氣充足的條件下具有較高活性，其活性的高低將顯著影響3-HP的產(chǎn)量。因此，目前在醛脫氫酶的篩選上做了大量的研究工作 (表1)，例如來源于Klebsiella pneumoniaeDSM 2026的醛脫氫酶PuuC［8］、 來源于巴西固氮螺菌 (Azospirillum brasilense)的 α-酮戊二酸半醛脫氫酶 KGSADH［9］、來源于羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的丙醛脫氫酶 PduP 等［10］。

圖1 甘油在微生物體內(nèi)的主要代謝路徑［7］Fig.1 The main metabolic pathway of glycerol in microorganisms

表1 已報道的醛脫氫酶Table 1 Some reported aldehyde dehydrogenase

2 3-羥基丙酸生物合成的代謝工程改造

早在20世紀60年代研究人員就開始了微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的研究。2001年，Suther等人首次報道了以甘油為底物，采用基因工程菌兩步法合成3-HP的研究［11］。他們克隆了來源于克雷伯氏肺炎桿菌的dhaB基因，以及分別來源于大腸桿菌、人類和釀酒酵母的4種醛脫氫酶基因。通過實驗發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的醛脫氫酶基因ald4效果最好，雖然最終3-HP產(chǎn)量僅為0.17 g/L，但為以甘油為底物生產(chǎn)3-HP的研究拉開了序幕。隨著甘油脫水酶和醛脫氫酶的不斷發(fā)現(xiàn)，愈來愈多的重組菌株被報道，其中尤以E.coli和K.pneumoniae為宿主菌研究最多。

2.1 以E.coli作為宿主合成3-HP

E.coli是開發(fā)最早的一種模式生物，它具有清楚的遺傳背景，易于改造，且生長條件簡單，對營養(yǎng)物質(zhì)要求低，因此被廣泛用于發(fā)酵生產(chǎn)許多高價值化工產(chǎn)品。就3-HP的合成來說，因其自身含有醛脫氫酶基因，因此采用E.coli作為宿主備受青睞。

表2所示為近年來以E.coli為宿主合成3-HP的主要研究，其中韓國Park團隊在此方面的工作尤為突出［8－9，12－15］。2008 年，Raj 等在 Suthers 的研究基礎(chǔ)上克隆了來源于K.pneumoniaeDSM 2026的甘油脫水酶基因dhaB和E.coliK-12的醛脫氫酶基因aldH，構(gòu)建了1株以甘油為底物生產(chǎn)3-HP的基因工程菌E.coliSH254。該菌以甘油 (100 mmol/L)為唯一碳源發(fā)酵30 h后，3-HP產(chǎn)量為0.58 g/L，甘油脫水酶活力為37 U/mg，醛脫氫酶活力為22.8 U/mg，得率為 0.48 mol/mol［12］。后續(xù)通過對搖瓶培養(yǎng)過程中pH、IPTG濃度、裝液量、底物濃度等條件的優(yōu)化，使3-HP的搖瓶產(chǎn)量提高到4.4 g/L;發(fā)酵罐中發(fā)酵72 h后，3-HP產(chǎn)量為31 g/L，得率為0.35 mol/mol，最大產(chǎn)率達 3.41 mmol/(g cell·h)［13］。

通過上述研究，Park團隊發(fā)現(xiàn)3-HP產(chǎn)量較低主要是由于甘油脫水酶的不穩(wěn)定性以及2種關(guān)鍵酶活性的不平衡造成的。為了穩(wěn)定甘油脫水酶的活性，該團隊克隆了甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB，并將此基因與dhaB基因進行了共表達，同時篩選了新的醛脫氫酶α-酮戊二酸半醛脫氫酶KGSADH。實驗結(jié)果表明含有dhaB-gdrAB和kgsadh基因的重組菌SHBGK1經(jīng)過5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)后，3-HP產(chǎn)量達到38.7 g/L。這一產(chǎn)量雖然較前人的研究有了較大的提高，但是過程中甘油轉(zhuǎn)化率仍然過低，僅為35%，主要原因還是醛脫氫酶活性偏低，導致雙酶表達不均衡，中間代謝產(chǎn)物3-羥基丙醛(3-HPA)積累產(chǎn)生細胞抑制毒性造成的［9］。

表2 以E.coli為宿主合成3-HPTable 2 3-HP production by recombinant E.coli

因此篩選高活力醛脫氫酶并對其進行分子改造，同時敲除3-HP的競爭途徑也是近年來提高產(chǎn)量和甘油轉(zhuǎn)化率的主要策略。Kim等克隆了來源于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的半醛脫氫酶PSALDH以及來源于短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的甘油脫水酶DhaB-DhaR，構(gòu)建了重組菌株E.coliBL21 star(DE3)，同時敲除了甘油競爭途徑中合成3-磷酸甘油的glpK基因和催化3-HPA合成1，3-PDO的yqhD基因，使3-HP產(chǎn)量大幅度提高達到57.3 g/L［7］。Chu等克隆了來源于鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)的新型醛脫氫酶GabD4，發(fā)現(xiàn)該酶對中間產(chǎn)物3-HPA的催化活性是目前所報道的最高值，而后續(xù)又對其進行了定點和飽和突變，使其活性提高到原始酶的1.4倍，敲除途徑中乙酰輔酶A合成乙酸的關(guān)鍵基因ackA-pta以及yqhD基因后，3-HP的產(chǎn)量也提高至目前的最高水平71.9 g/L［16］。

目前，國內(nèi)眾多科研院校也相繼開展了利用重組大腸桿菌合成3-HP的研究。江南大學張曉梅等構(gòu)建了同時表達DhaB和AldH的基因工程菌E.coliJM109，該菌在含有50 g/L甘油的發(fā)酵液中培養(yǎng)48 h，3-HP產(chǎn)量為4.92 g/L，甘油利用率為50.12%，轉(zhuǎn)化率為12.3%［18］。后續(xù)考察了甘油脫水酶激活因子(gdrAB)對3-HP合成量的影響，發(fā)現(xiàn)菌株中重組gdrAB后，3-HP合成量提高了6.4倍［19］。南京工業(yè)大學的胡南等以自身攜帶有乙醛脫氫酶的E.coliBL21(DE3)plysS作為宿主，異源表達了來源于K.pneumoniae的dhaB基因，重組菌E.coliHP獲得的甘油脫水酶比活力在1 mmol/L IPTG的誘導下達到77.2 U/mg，搖瓶條件下3-HP的產(chǎn)量達到了5.44 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為53%［20］。

在發(fā)酵過程中，甘油除了合成3-HP外，還作為碳源進行同化作用合成細胞，并有部分甘油經(jīng)過氧化最終生成ATP和還原力。因此，采用E.coli作為宿主最主要的問題還要提高甘油合成3-HP的轉(zhuǎn)化效率。Jung等人除了敲除3-HP的競爭途徑外，還研究了甘油的代謝速率對3-HP合成的影響，主要考察了甘油激酶GlpK(將甘油轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油)、甘油促進因子GlpF(促進甘油由胞外到胞內(nèi)的吸收)，以及甘油途徑調(diào)節(jié)因子GlpR(控制甘油的整體代謝途徑)等的影響。發(fā)現(xiàn)甘油途徑調(diào)節(jié)因子GlpR是影響甘油代謝的主要抑制因素，該途徑的敲除可以激活甘油的分解代謝，提高3-HP的合成產(chǎn)量。敲除副產(chǎn)物乙酸和1，3-丙二醇的合成途徑后3-HP產(chǎn)量為28.1 g/L，而在此基礎(chǔ)上過量表達glpk基因并敲除glpR基因后，甘油的利用速率顯著增加，3-HP的產(chǎn)量也提高至40.5g/L;而如果在敲除glpR基因的基礎(chǔ)上過量表達glpF基因后，3-HP 的產(chǎn)量會提高至 42.1 g/L［17］。

2.2 以K.pneumoniae作為宿主合成3-HP

在3-HP合成過程中，甘油脫水酶發(fā)揮催化活性需要輔酶VB12的參與，而K.pneumoniae自身能夠在微氧或厭氧的條件下合成VB12，這在很大程度上解決了昂貴的輔酶添加問題，降低了生產(chǎn)成本。并且K.pneumoniae自身含有甘油脫水酶基因，可以直接利用甘油合成3-HPA，因此，采用K.pneumoniae作為宿主合成3-HP的研究也越來越多。K.pneumoniae遺傳背景與進化方向與大腸桿菌相近，可相互進行基因操作。另外，與E.coli相比，K.pneumoniae代謝利用甘油能力較強，同化率高，無需額外添加碳源，且甘油途徑得到了詳細的解析。

在K.pneumoniae以甘油為底物進行發(fā)酵的過程中會生成另一種重要的化工產(chǎn)品1，3-PDO，因此以K.pneumoniae作為宿主的另一個優(yōu)勢是可以實現(xiàn)兩種重要化工產(chǎn)品的聯(lián)產(chǎn)，且3-HP和1，3-PDO聯(lián)產(chǎn)可實現(xiàn)輔因子NAD+的再生平衡［21］。國內(nèi)華東理工大學在此方面的工作較為突出，HUANG等構(gòu)建重組菌K.pneumoniae成功表達了E.coli的aldH基因，在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵24 h后，3-HP和1，3-PDO的產(chǎn)量分別達到24.4 g/L和49.3 g/L，甘油的總轉(zhuǎn)化率達到0.61 mol/mol，實驗證明在不添加VB12情況下可以成功合成3-HP和1，3-PDO［22］。如前所述，甘油脫水酶與醛脫氫酶對氧氣的需求是不同的，為了平衡兩者的活性，HUANG等人還考察了不同的通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速對3-HP合成的影響，發(fā)現(xiàn)在微氧的條件下 (1.5 vvm)適當提高攪拌轉(zhuǎn)速可以使3-HP產(chǎn)量增加至48.9g/L，而使 1，3-PDO 的產(chǎn)量降低至 25.3g/L［23］。后續(xù)該課題組對已構(gòu)建的重組菌K.pneumoniae(pUC18kan-aldHec)以甘油為底物生產(chǎn)3-HP和1，3-PDO的過程進行發(fā)酵過程的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)補料階段控制甘油濃度在20～30 g/L，發(fā)酵26 h后3-HP和1，3-PDO的產(chǎn)量分別達到47.2 g/L和43.9 g/L;而間歇性補加甘油時，產(chǎn)物得率最高，發(fā)酵26 h后，甘油合成3-HP和1，3-PDO的總轉(zhuǎn)化率可以達到0.73 mol/mol［21］。

表3 以K.pneumoniae作為宿主合成3-HPTable 3 3-HP production by recombinant K.pneumoniae

在以K.pneumoniae為宿主合成3-HP的過程中，敲除副產(chǎn)物的代謝途徑依然是研究的重要方向。Luo等人通過滅活K.pneumoniae中的甘油脫氫酶使代謝過程中氧化途徑缺失，同時將NAD+依賴型的醛脫氫酶AldHk克隆到宿主菌中，發(fā)現(xiàn)3-HP的產(chǎn)量可以提高3.6倍［24］。Ashok等人還考察了甘油脫水酶與醛脫氫酶的酶活對氧氣需求不匹配的問題，他們將NAD+依賴型的新型醛脫氫酶 PuuC(γ-谷氨酰-γ-氨基丁醛脫氫酶)克隆于K.pneumoniae中，該重組菌可以在微氧條件下有效地將3-HPA轉(zhuǎn)化為3-HP和1，3-PDO，而PuuC為NAD+輔酶依賴型，微氧條件會提高NADH的量而不利于NAD+的循環(huán)，并且在以氧氣為電子受體的NADH/NAD+輔酶循環(huán)過程中會伴隨大量的1，3-PDO和乳酸生成，因此在發(fā)酵過程中嘗試采用硝酸鹽作為NADH的電子受體來完成NAD+的循環(huán)，結(jié)果表明硝酸鹽的加入可以提高NAD+的循環(huán)量，但是由甘油合成3-HP的碳流并沒有增加，后續(xù)又通過對影響甘油代謝速率和1，3-PDO產(chǎn)量的相關(guān)基因glpK和dhaT(1，3-丙二醇氧化還原酶)進行敲除，使得甘油合成3-HP的轉(zhuǎn)化率提高到30%，發(fā)酵罐中 3-HP 的產(chǎn)量提高到 22.5g/L［15，25］。而繼續(xù)敲除yqhD基因后，增大了由3-HPA流向3-HP碳流，在發(fā)酵過程中優(yōu)化通氣量，以5%的溶氧量發(fā)酵48 h后3-HP產(chǎn)量提高至28 g/L［26］。除了尋找NADH的電子受體外，在體內(nèi)進行多酶共表達進行輔因子NAD(P)+再生也是一個主要方向，曹寧等引入釀酒酵母(S.cerevisiae)的3-磷酸甘油脫氫酶基因GPD1，得到耦合3-HP合成與NAD+再生的重組菌K.pneumoniae(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)，微氧條件下，搖瓶中發(fā)酵15 h后，3-HP產(chǎn)量達到1.45 g/L，是攜帶空載體菌的2.39倍［27］。

在以K.pneumoniae為宿主合成3-HP的研究中，還有學者嘗試采用靜息細胞對底物甘油進行轉(zhuǎn)化，該方法的優(yōu)點是可以在有氧條件下培養(yǎng)活細胞，然后在微氧或無氧條件下利用甘油進行轉(zhuǎn)化合成3-HP。Kumar等以kgsadh基因作為醛脫氫酶基因構(gòu)建重組菌K.pneumoniaeJ2B，采用靜息細胞催化法在1.5 L反應(yīng)器中厭氧分批轉(zhuǎn)化12 h后，3-HP質(zhì)量濃度為11.3 g/L，1，3-PDO質(zhì)量濃度為15.2 g/L，總轉(zhuǎn)化效率可以達到0.71 mol/mol。但是除了上述產(chǎn)物之外還有大量乳酸產(chǎn)生，因此在后續(xù)的工作中將該重組菌中的ldhA(乳酸脫氫酶)基因進行敲除，同樣采用靜息細胞轉(zhuǎn)化后，3-HP和1，3-PDO產(chǎn)量分別提高到22.7 g/L 和 23.5 g/L［28－29］。

續(xù)表3

2.3 其他宿主

由甘油合成3-HPA的關(guān)鍵酶甘油脫水酶為輔酶VB12依賴型，因此，篩選能夠自身合成VB12的菌株，減少輔酶添加，降低發(fā)酵成本，也是目前的一個研究方向。脫氮假單胞菌(Pseudomonas denitrificcans)是目前工業(yè)生產(chǎn)VB12的常用菌株，該菌株可以在有氧條件下自身合成輔酶VB12，同時有氧條件下輔酶NAD+也能夠進行有效地再生，是3-HP合成的理想宿主。

Park團隊將前述的甘油脫水酶及其再激活酶基因(dhaB/gdrAB)以及來源于K.pneumoniae的醛脫氫酶基因puuC共表達于P.denitrificans宿主細胞中構(gòu)建了基因工程菌株，發(fā)現(xiàn)該重組菌可以葡萄糖作為碳源和能源進行生長，而在培養(yǎng)基中添加甘油后可以產(chǎn)生5 g/L左右的3-HP，雖然3-HP的產(chǎn)量不高，但是為以甘油為底物合成3-HP提供了新的研究方向［30］。后續(xù)該團隊也在VB12產(chǎn)生菌的篩選方面做了一些工作，篩選到1株在好氧條件下合成VB12的菌株P(guān)seudomonassp.SP2，該菌株也為后續(xù)3-HP的研究提供了基礎(chǔ)［31］。

3 研究展望

目前，以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的研究中，3-HP的最高產(chǎn)量為71.9 g/L，而據(jù)文獻報道有機酸的商業(yè)化生產(chǎn)需要達到100 g/L以上［32］。因此，為了盡快實現(xiàn)3-HP的工業(yè)化生產(chǎn)，需要深入研究甘油生產(chǎn)3-HP途徑中的限制性因素，提高關(guān)鍵酶的活性及底物轉(zhuǎn)化率。在以甘油為底物，利用甘油脫水酶將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛，醛脫氫酶進一步將3-羥基丙醛氧化為3-羥基丙酸的途徑中，存在著甘油脫水酶不穩(wěn)定性和自殺性滅活、醛脫氫酶酶活力偏低、兩種酶對氧氣的需求不匹配、中間產(chǎn)物3-HPA的累積毒性、產(chǎn)物3-HP積累毒性以及VB12供給和輔酶循環(huán)再生等問題。其中，甘油脫水酶得到了深入的研究，表達甘油激活因子解決了它的不穩(wěn)定性和自殺性滅活問題;甘油脫水酶DhaB蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的確定為它的分子改造提供了理論基礎(chǔ)。而低活力的醛脫氫酶作為限速步驟，限制了3-HP的產(chǎn)量，導致中間產(chǎn)物3-HPA的累積，3-HPA對細胞具有抑制毒性，因此繼續(xù)篩選高活力醛脫氫酶，使3-HPA迅速轉(zhuǎn)化為3-HP還是今后研究的重要方向。獲得適應(yīng)性強、酶活高、穩(wěn)定性好的醛脫氫酶，除了定向進化、理性設(shè)計和半理性設(shè)計等方法外，還可以采用宏基因組學進行尋找。內(nèi)源輔酶NAD(P)+濃度和再生對醛脫氫酶活性和3-HP產(chǎn)量有著不可忽略的影響，在今后的研究中我們可以參考其他氧化還原酶的一些解決策略來提高NAD(P)+的循環(huán)量，如多酶共表達進行輔酶再生或者電化學等方法，而解決NAD(P)H/NAD(P)+高比例對酶活力抑制問題也需要進一步的研究，如尋找適當?shù)腘ADH電子受體等。近幾年的研究使3-HP的產(chǎn)量得到很大的提高，菌株能否耐受高3-HP濃度將成為3-HP工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，高耐受菌株的選育或基因缺陷型菌株的發(fā)現(xiàn)也必將成為今后研究的重點。

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