李冬梅，李歡，李世偉，孫彤，董志儉，勵建榮

1(渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)2(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州，225300)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國對蝦蝦頭凍干粉，實驗室自制;風味蛋白酶(Flavorzyme)，500 LAPU/g，諾維信公司;復(fù)合蛋白酶(Protamex)，1.5 AU/g，諾維信公司;堿性蛋白酶(Alkaline protease)，200 u/mg，上海華藍化學科技有限公司;木瓜蛋白酶(Papain)，100 u/mg，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;中性蛋白酶(Neutral protease)，200 u/mg，上海華藍化學科技有限公司;木糖，食品級。

PB-10 pH計，賽多利斯公司;賽康BL301B3絞肉機，上海賽康電器有限公司;油浴鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;固相微萃取裝置，美國Supelco公司;SPME萃取頭(50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Stableflex 2cm);氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司(7890A，5975C);氨基酸分析儀L-8900，日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中國蝦頭蛋白水解產(chǎn)物的制備

1.2.1.1 樣品前處理方法

將中國對蝦蝦頭清洗干凈，經(jīng)冷凍干燥后絞碎，即為蝦頭凍干粉，抽真空密封后于0℃保存待用。

1.2.1.2 水解液的制備

準確稱取樣品按水料質(zhì)量比4∶1加水后，加入底物質(zhì)量2.5%的蛋白酶。調(diào)節(jié)體系初始pH到各蛋白酶的最適 pH(Flavorzyme pH 6.5，Papain pH 6.5，Alkaline protease pH 8.0，Neutral protease pH 6.5，Protamex pH 6.0)，置于各蛋白酶最適溫度下酶解，于80℃滅酶5 min，5 000 r/min離心10 min后取上清液定容即得。

1.2.1.3 蝦頭蛋白水解度的測定

(1)總氮的測定:自動凱氏定氮法，經(jīng)3次測定求平均值，求得總氮含量(X0)。

(2)氨基態(tài)氮的測定:甲醛電位滴定法［4］。

(3)水解度的計算:DH/%=X/X0×100。X為酶解液中氨基氮質(zhì)量;X0為樣品中總氮質(zhì)量。

1.2.1.4 多肽含量的測定［6］

雙縮脲試劑:A液，0.1 g/mL NaOH溶液;B液，0.01 g/mL CuSO4溶液。取2.5 mL經(jīng)1倍稀釋的水解液，加2.5 mL 10%的三氯乙酸混勻，靜置10 min，在5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL測定，加4 mL 0.1g/mL NaOH溶液混勻后，加3 mL CuSO4混勻，室溫靜置30 min，于540 nm處比色，并用蒸餾水做對照。

1.2.2 游離氨基酸含量測定

將待測樣品經(jīng)等體積的10%磺基水楊酸溶液沉淀蛋白后，14 000 r/min離心15 min，稀釋到適當濃度后，再用0.22 μm水系濾膜過濾，通過L-8900氨基酸分析儀分析其氨基酸含量。

1.2.3 蝦頭蛋白水解液MPRs的制備

稱取5%的木糖于水解4 h的各蛋白酶水解液中并攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.8，封口，于115℃的油浴鍋中反應(yīng)20 min后取出，迅速于冰浴中冷卻備用。

1.2.4 蝦頭蛋白水解液MPRs揮發(fā)性成分測定

在20 mL的樣品瓶中裝入5 mL蝦頭蛋白水解液MPRs，將頂空瓶放入50℃恒溫水浴中平衡20 min，再將已老化好的SPME針頭插入樣品瓶中，用手柄將石英纖維頭暴露到頂空氣體中萃取30 min后，用手柄使纖維頭推回到針頭內(nèi);拔出針頭，將吸附了分析組分的萃取頭插入GC-MS進樣器中，使待測組分解吸，進入GC-MS進行分離與分析。

1.2.5 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析

1.2.5.1 氣相色譜條件

柱子型號:VF-5 ms，30m ×0.25 mm ×0.25 μm;柱溫:初始溫度40℃ 4 min，升溫速率5℃/min，終溫240℃ 5 min;進樣口溫度:250℃;柱流速:1.0 mL/min;載氣:He(99.999%)。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件

掃描范圍:采集的質(zhì)量范圍30～550 amu;傳輸溫度:280℃;四級桿溫度:220℃。

1.2.5.3 揮發(fā)性化合物的鑒定

根據(jù)GC-MS分析對蝦頭蛋白水解液MRPs中揮發(fā)性化合物鑒定，將分離出的化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與經(jīng)計算機檢索標準譜圖庫相匹配。

1.2.5.4 揮發(fā)性化合物相對含量的確定

采用峰面積歸一化法

1.2.6 感官評定

通過添加0.5%的NaCl評價MRPs的風味特征，同時以0.5%的NaCl溶液作為對照溶液，60℃恒溫水浴恒溫10 min，進行感官評定。打分采用7分制，將0.5%的NaCl溶液設(shè)定為3分，分值越大表明作用效果越強。感官評定小組由6位感官經(jīng)驗較豐富的評定人員(3男3女)分別對各感官指標(鮮味、醇厚味、持續(xù)感和焦甜味)進行評分。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦頭蛋白水解過程中蛋白水解度變化

由圖1可以看出，隨著水解時間的延長，5種蛋白酶對中國對蝦蝦頭蛋白的水解度都呈逐漸升高的趨勢，但每種蛋白酶對蝦頭蛋白的水解能力各不相同。其中Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease在水解蝦頭蛋白過程中的水解度相對較高，Protamex雖然在初期的水解度很低，但3 h后水解度有較大提高，Papain對蝦頭蛋白水解能力較差，不適合蝦頭蛋白的水解。

圖1 蝦頭蛋白水解過程中水解度變化Fig.1 Change of hydrolysis degrees during the hydrolysis of shrimp head protein

2.2 蝦頭蛋白水解過程中多肽含量變化

圖2是不同蛋白酶水解蝦頭蛋白過程中多肽含量變化。由圖2可知，5種蛋白酶水解液中多肽含量在水解過程中都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;李艷紅［6］在利用排阻色譜法研究鷹嘴豆蛋白酶解物的過程中發(fā)現(xiàn)，隨著水解程度的加深，酶解物的相對分子質(zhì)量分布總體表現(xiàn)為大分子質(zhì)量肽含量逐漸減少，小分子量肽含量逐漸增多，隨后，小分子質(zhì)量肽段被進一步水解成分子質(zhì)量更小的肽段或氨基酸，因此，酶解物中多肽含量在水解后期有所下降。然而，不同蛋白酶水解蝦頭蛋白過程中多肽含量變化各有特點:Protamex和Papain水解液中多肽含量相對較高，而Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease水解液中多肽含量較低。結(jié)合圖1和圖2可知，Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease對蝦頭蛋白的水解程度較大，但水解液以氨基酸為主，多肽含量較低;Papain水解液中多肽含量雖然較高，但其對蝦頭蛋白的水解程度較弱;與以上4種蛋白酶相比，Protamex對蝦頭蛋白具有較好的水解能力，同時水解液中多肽含量相對較高。

圖2 蝦頭蛋白水解過程中多肽含量變化Fig.2 Change of peptide contents during the hydrolysis of shrimp head protein

2.3 蝦頭蛋白水解液Maillard反應(yīng)前后氨基酸組成變化

表1是蝦頭蛋白水解液Maillard反應(yīng)前后氨基酸組成變化分析結(jié)果。其中Alkaline protease水解液中氨基酸總含量最高，其次是Neutral protease、Protamex和Flavorzyme水解液，而Papain水解液中氨基酸總含量最低。5種蛋白酶水解液中氨基酸總含量在Maillard反應(yīng)后均有所降低，消耗量最大的氨基酸主要有半胱氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸。圖3是不同蛋白酶水解液Maillard反應(yīng)過程中鮮味氨基酸和含硫氨基酸的消耗量;Protamex水解液中鮮味氨基酸的總消耗量為負值，說明Maillard反應(yīng)過程中由多肽降解產(chǎn)生的鮮味氨基酸與原有鮮味氨基酸的總含量大于反應(yīng)過程中消耗的鮮味氨基酸含量，這對MRPs的鮮味貢獻作用較大;而其他4種蛋白酶水解液中鮮味氨基酸消耗量主要為正值。據(jù)文獻報道［7］，含硫氨基酸的消耗對MRPs的肉香香氣貢獻較大;由圖3也可看出，5種蛋白酶水解液中含硫氨基酸的消耗量都為正值，這說明Maillard反應(yīng)促使水解液中的含硫氨基酸生成呈香物質(zhì)?？偟膩砜矗魉庖褐斜匦璋被岷孔兓淮?。

表1 蛋白酶水解液及其MRPs中氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of protein hydrolysates and their MRPs

2.4 不同蛋白酶水解液MRPs揮發(fā)性成分分析

由圖4可以看出，Protamex水解液MRPs中檢測出的含氮雜環(huán)化合物、含硫化合物和含氧雜環(huán)化合物的含量都較高，其中含氮雜環(huán)化合物2，5-二甲基吡嗪相對含量達到5.58%(見表2)，該化合物具有烤香味和堅果香味［8－9］，含硫化合物二甲基二硫和二甲基三硫的相對含量分別為5.63%和3.21%(見表2)，這兩種化合物通常具有特征的烤肉香氣、堅果氣味及洋蔥氣味，對蝦香味和肉香味具有重要貢獻［2，10］;Alkaline protease 水解液 MRPs中含氮雜環(huán)化合物和含硫化合物含量也較高，其中檢測出的2-甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、二甲基二硫和二甲基三硫的含量分別為2.50%、6.38%、4.52%和2.35%(見表2)，使其Maillard產(chǎn)物具有較強的烤肉特征風味;對于Neutral protease來說，其MRPs中含氮雜環(huán)化合物與酮類化合物含量較高，檢測出的2，3-辛二酮具有奶香味和果甜香味，常用于做焙烤香精［11］;同時檢測出的2，5-二甲基吡嗪和嘧啶使其燒烤的特征風味明顯;而Papain和Flavorzyme水解液MRPs中檢測出的含氮、氧雜環(huán)化合物、含硫化合物和酮類化合物的含量都相對較低，其特征風味較不明顯。由此可以看出，酶的種類不同，其各自的MRPs揮發(fā)性特征成分具有較大差異，這與水解產(chǎn)物中氨基酸與多肽的組成與含量有較大關(guān)系;據(jù)相關(guān)文獻報道，蛋白水解液MPRs揮發(fā)性成分的形成主要取決于水解液中氨基酸組成、多肽分子質(zhì)量分布及肽的構(gòu)成方式等［12］，分子質(zhì)量在1 000～5 000 Da的多肽在美拉德反應(yīng)過程中會產(chǎn)生較強的肉香味［13］，隨著游離氨基酸和小分子質(zhì)量寡肽的增多，美拉德反應(yīng)后生成的吡嗪類風味物質(zhì)增多，醛類物質(zhì)的種類減少［14］;而蛋白酶的種類是影響蛋白水解液中多肽結(jié)構(gòu)和氨基酸組成不同的主要因素之一。

圖4 不同蛋白水解液MRPs中特征風味化合物Fig.4 Characteristic flavor compounds of MRPs derived from different protein hydrolysates

2.5 不同蛋白酶水解液MRPs的感官評價

圖5為5種蛋白酶水解液MRPs的感官評定結(jié)果。5種MRPs主要呈鮮味、醇厚味和焦甜味，持續(xù)感較強，酸味和苦味較淡。其中，焦甜味、酸味和苦味差別不大;FM鮮味稍強，但持續(xù)感和醇厚味較差;PaM持續(xù)感和醇厚味一般，但鮮味較差;NM無論是鮮味、持續(xù)感還是醇厚味都相對較差;AM具有較強的鮮味，但其持續(xù)感和醇厚味相對較差;PrM的鮮味、持續(xù)感和醇厚味都相對較強。Protamex水解液在Maillard反應(yīng)過程中，其鮮味氨基酸含量增加(見圖4)，因此，其PrM在感官評定中呈現(xiàn)較強的鮮味;而鮮味、持續(xù)感和醇厚味可歸因于水解液中的呈鮮味或有鮮味增強作用的小肽類物質(zhì)，這些肽類物質(zhì)在發(fā)生美拉德反應(yīng)后可使體系中的鮮味、持續(xù)感和醇厚味明顯增強［15］。

圖5 不同蛋白水解液MRPs感官評定Fig.5 Sensory evaluation of MRPs derived from different protein hydrolysates

3 結(jié)論

(1)隨著水解時間的延長，5種蛋白酶對中國對蝦蝦頭蛋白的水解程度逐漸加深，氨基酸含量逐漸增大，多肽含量先升高后降低。其各自水解產(chǎn)物經(jīng)美拉德反應(yīng)后，游離氨基酸含量普遍降低，MRPs揮發(fā)性特征成分具有較大差異，其感官滋味強弱不同，主要呈鮮味、醇厚味和焦甜味，持續(xù)感較強，酸味和苦味較淡。

(2)Protamex水解液中多肽和游離氨基酸含量都相對較高，其MRPs具有較強的肉香味、海鮮味和烤肉香味等特征風味，鮮味氨基酸含量有所升高，其鮮味、持續(xù)感和醇厚味等感官滋味都相對較強。因此，復(fù)合蛋白酶比較適合對蝦頭蛋白水解，并通過Maillard反應(yīng)進一步制備鮮味肽或鮮味增強肽。

表2 不同蛋白水解液MRPs的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile compounds of MRPs derived from different protein hydrolysates

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