張 悅，李蓓蓓，魏建超，邵東華，劉 珂，石元元，邱亞峰，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

上海副豬嗜血桿菌分離鑒定及其耐藥性分析

張 悅，李蓓蓓，魏建超，邵東華，劉 珂，石元元，邱亞峰，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本研究旨在調(diào)查我國上海副豬嗜血桿菌對臨床常用抗菌藥的耐藥情況，為該病的臨床用藥與防治提供數(shù)據(jù)支持。2013～2014年從上海市多個屠宰場采集樣品以及送檢病料共計484份，采用細(xì)菌分離培養(yǎng)及PCR的方法，分離鑒定出62株副豬嗜血桿菌。采用微量瓊脂稀釋法測定21種臨床常用抗菌藥的最小抑菌濃度。藥物敏感性測定結(jié)果表明，所有菌株都對阿奇霉素、替米考星、泰妙菌素、阿米卡星、頭孢噻呋和左氧氟沙星敏感，超過90%的菌株對紅霉素（60， 96.8%）、氟苯尼考（59， 95.3%）、氯霉素（60， 96.8%）、慶大霉素（60， 96.8%）、壯觀霉素（61， 98.4%）、青霉素（57， 91.9%）、氨芐青霉素（57， 91.9%）和環(huán)丙沙星（61， 98.4%）敏感，但對四環(huán)素和恩諾沙星耐藥率較高，分別為75.8%（47）和30.6%（19）。耐藥譜分析顯示，37.1%的菌株對兩種以上的抗菌藥耐受。本研究結(jié)果顯示上海市副豬嗜血桿菌對臨床常用抗菌藥物耐藥總體狀況尚不嚴(yán)重，但針對多個臨床常用藥物的耐藥菌株已經(jīng)出現(xiàn)，應(yīng)對其耐藥性進(jìn)行長期監(jiān)測。

副豬嗜血桿菌；抗菌藥；耐藥；豬

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， Hps）在特定條件下侵入豬體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病，稱革拉瑟氏?。℅l?sser's disease）［1］。近年來該病在集約化豬場內(nèi)發(fā)病率呈明顯上升趨勢，主要引起從哺乳到保育的不同階段仔豬死亡，生長發(fā)育不良，飼料利用率降低等問題［2］。通過使用疫苗可以控制副豬嗜血桿菌病，但是已有報道表明血清型多樣性和大量無法分型的菌株對于交叉保護(hù)性疫苗的研制存在負(fù)面影響［1］。目前副豬嗜血桿菌病的防治主要依靠抗菌藥治療，但由于抗菌藥長期盲目地使用，Hps對臨床常用抗菌藥已產(chǎn)生不同程度的耐藥，耐藥菌株的盛行給該病的治療帶來了極大挑戰(zhàn)，所以臨床上對其藥物敏感性進(jìn)行長期監(jiān)控成為防治的關(guān)鍵。

國外對Hps的耐藥性有大量研究，結(jié)果顯示丹麥、英國、西班牙等國Hps的耐藥性差異很大［3，4］，這可能與各國批準(zhǔn)使用的抗生素的種類及抗生素的使用方式有關(guān)。2000年以來，中國國內(nèi)關(guān)于豬場多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道陸續(xù)增多，特別是近幾年急驟上升。在中國Hps臨床分離株中，針對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、大觀霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、恩諾沙星、泰妙菌素、耐萘啶酸和三甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲噁唑等臨床常用藥物的耐藥菌株已經(jīng)出現(xiàn)［5，6］。本研究對2013～2014年本實驗室分離鑒定的Hps進(jìn)行耐藥性分析，為該病的臨床用藥與防治提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2013～2014年在上海市多個屠宰場，采集待宰豬（來源于上海市、江蘇省、江西省、河南省、浙江省、安徽省的養(yǎng)殖場）的鼻拭子和病變肺組織，以及上海市及周邊生豬養(yǎng)殖場送檢病料，共計484份。

1.1.2 質(zhì)控菌株 胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）ATCC27090購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3 主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）購自英國Oxoid公司；新生牛血清購自杭州四季青材料有限公司；輔酶I（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+）購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏試驗受試藥物包括：克林霉素（Clindamycin，CLI）、阿奇霉素（Azithromycin，AZM）、紅霉素（Erythromycin，ERY）、替米考星（Tilmicosin，TIL）、泰妙菌素（Tiamulin，TIA）、氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)FC）、氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、四環(huán)素（Tetracycline，TET）、多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、阿米卡星（Amikacin，AMK）、卡那霉素（Kanamycin，KAN）、安普霉素（Apramycin，APR）、壯觀霉素（Spectinomycin，SPE）、頭孢噻呋（Ceftiofur，CEF）、阿莫西林（Amoxicillin，AMX）、青霉素（Penicillin，PEN）、氨芐青霉素（Ampicillin，AMP）、左氧氟沙星（Levofloxacin，LEV）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENO）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）共21種藥物，其中替米考星、泰妙菌素、氟苯尼考、安普霉素、頭孢噻呋、恩諾沙星和多西環(huán)素購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；其余均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 從豬肺臟、鼻腔、脾臟、關(guān)節(jié)等組織器官中無菌取樣，分別接種于含NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）和5%小牛血清的TSA（胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基）平板，5%CO2、37℃培養(yǎng)24～48h，觀察菌落形態(tài)，挑取可疑單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)并鑒定。

1.2.2 PCR檢測 根據(jù)Oliveira等［7］設(shè)計的Hps檢測引物（見表1），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。對菌株進(jìn)行16SrDNA（M75065）測序，通用引物（27F和1492R，見表1）由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 藥敏試驗 美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)系會（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）中尚無Hps藥物敏感性測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）與Hps親緣性較近且均為豬呼吸道病的病原菌，所以本實驗采用CLSI（2013）中規(guī)定的胸膜肺炎放線桿菌藥敏測定方法。根據(jù)CLSI推薦的方法采用瓊脂稀釋法，測定62株Hps對21種抗菌藥的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MICs）。以胸膜肺炎放線桿菌ATCC27090作為質(zhì)控菌株。料分離率最高，為29.3%（12/41），C、D和E屠宰場分離率最低。

表 1 PCR 擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌的形態(tài)特征 Hps屬于兼性厭氧菌，初次分離培養(yǎng)時供給5%～10%的CO2可促進(jìn)生長。在TSA固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24～48 h，生長的菌落呈圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落［8］，見圖1。

圖 1 副豬嗜血桿菌分離株在 TSA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of H. parasuis isolates in TSA

2.2 副豬嗜血桿菌PCR鑒定與測序 對分離菌進(jìn)行PCR初步鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物為822 bp大小的片段。選取菌株C3進(jìn)行測序，證實其序列與Hps 16S rDNA序列相符，以C3菌株作為PCR初步檢測的陽性對照，結(jié)果見圖2。Hps一般條件下難以分離和培養(yǎng)，檢出率較低，本次調(diào)查共采集484個樣品，最終分離到62株Hps。Hps 分離率僅為12.8%，由表2可知，養(yǎng)殖場病

圖2 副豬嗜血桿菌分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 The result of PCR for H. parasuis isolates

2.3 抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果

2.3.1 副豬嗜血桿菌耐藥性 當(dāng)質(zhì)控菌株的MICs在規(guī)定范圍時，記錄試驗菌株的結(jié)果。細(xì)菌耐藥臨界點參照CLSI相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。62株Hps對21種抗菌藥的MIC見表3。由表可知，所有菌株都對阿奇霉素、替米考星、泰妙菌素、阿米卡星、頭孢噻呋和左氧氟沙星敏感，其中90%以上菌株對紅霉素（60，96.8%）、氟苯尼考（59，95.3%）、氯霉素（60，96.8%）、慶大霉素（60，96.8%）、壯觀霉素（61，98.4%）、青霉素（57，91.9%）、氨芐青霉素（57，91.9%）和環(huán)丙沙星（61，98.4%）敏感。對四環(huán)素和恩諾沙星耐藥率較高，分別為75.8%和30.6%?？傮w而言，本研究中Hps對四環(huán)素類、氟喹諾酮類藥物藥物耐藥率相對較高，對β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類也存在一定程度的耐藥，但不顯著。因為CLSI-折點沒有有關(guān)克林霉素、卡那霉素、安普霉素、阿莫西林、多西環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)，故耐藥株的比例無法確定。

表 2 2013～2014 年副豬嗜血桿菌分離率Table2 The isolation rate of Haemophilus parasuis in 2013-2014

2.3.2 多重耐藥性與耐藥譜 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果對試驗菌株多重耐藥性進(jìn)行分析可知，Hps耐1種和2種藥物的菌株數(shù)最高，9.7%的菌株對3種以上的抗菌藥耐受，37.1%的菌株對2種以上的抗菌藥耐受。Hps可最多同時耐5種藥物，但耐藥菌株比例較低少（1.6%），見表4。本研究主要耐藥譜型有17種，見表5。

表 4 副豬嗜血桿菌的多重耐藥性Table 4 Multiple resistance of Haemophilus parasuis

3 討論

近年來，副豬嗜血桿菌病在養(yǎng)殖場發(fā)生率逐年升高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大損失，而其細(xì)菌耐藥性問題也已引起各國科學(xué)家關(guān)注。在丹麥Hps臨床分離株中，發(fā)現(xiàn)三甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲噁唑耐藥菌株［3］。在英國和西班牙Hps臨床分離株中，發(fā)現(xiàn)英國分離株僅20%的菌株對新霉素耐藥，而西班牙分離株對青霉素、氨芐青霉素、土霉素、紅霉素、替米考星、硫姆林和三甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲噁唑都存在耐藥現(xiàn)象。此外，西班牙菌株中存在多重耐藥菌株，其中23.3%菌株可耐8種抗菌藥物以上［4］。丹麥、西班牙和英國試驗菌株中均未發(fā)現(xiàn)耐氟苯尼考菌株［3，4］，由于氟苯尼考極高的活性，它已成為Hps感染治療傳統(tǒng)藥物的優(yōu)秀替代品。氟苯尼考屬氯霉素類廣譜抗菌藥，是用于臨床防治豬呼吸道細(xì)菌病的重要藥物。在針對Hps耐藥性研究文獻(xiàn)中，包括丹麥、西班牙以及中國均未發(fā)現(xiàn)氟苯尼考耐藥菌株。值得注意的是，本研究中首次發(fā)現(xiàn)3株Hps表現(xiàn)氟苯尼考耐藥（MICs=8μg/mL），后續(xù)將對其耐藥機制進(jìn)行深入研究。

表5 副豬嗜血桿菌抗菌譜Table 5 Antibacterial spectrum of Haemophilus parasuis

2000年以來，我國其他各地關(guān)于豬場發(fā)生多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道陸續(xù)增多，特別是近幾年急驟上升。在中國臨床分離株中，Zhou等［5］對110株Hps進(jìn)行了耐藥流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)存在較多的恩諾沙星和三甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲噁唑的耐藥菌株，同時發(fā)現(xiàn)耐青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、大觀霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和泰妙菌素等的菌株；Xu等［6］對112株Hps進(jìn)行了耐藥流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)存在較多的耐萘啶酸和三甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲噁唑的菌株，少數(shù)菌株對頭孢噻肟、頭孢他啶、氯霉素和慶大霉素也存在耐藥現(xiàn)象。研究顯示Hps臨床抗菌藥物耐藥情況逐漸增多，對養(yǎng)殖業(yè)帶來越來越大的損失，因此做好臨床耐藥性監(jiān)測成為獸醫(yī)工作者的重中之重。本次調(diào)查結(jié)果顯示，Hps對四環(huán)素類、氟喹諾酮類藥物耐藥率相對較高，對β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類也存在一定程度的耐藥，但并不顯著。Hps多重耐藥現(xiàn)象并不十分嚴(yán)重，共23株菌（37.1%）對2種以上的抗菌藥耐受，6株菌（9.7%）對3種以上的抗菌藥耐受。

在實際生產(chǎn)中常用大量抗菌藥來治療細(xì)菌性疾病，誤用、濫用抗菌藥對細(xì)菌產(chǎn)生較強的藥物選擇壓力，從而使得細(xì)菌耐藥情況愈加突出。雖然本次調(diào)查顯示耐藥情況并不十分突出，但值得注意的是，Hps對臨床常用的四環(huán)素類、氟喹諾酮類抗菌藥已產(chǎn)生較強耐藥性。因此，建議在實際生產(chǎn)中，采用細(xì)菌體外分離培養(yǎng)與鑒定確診病原后，結(jié)合藥敏試驗結(jié)果有針對性的用藥，避免盲目濫用、長期使用同種抗菌藥物。同時可對養(yǎng)殖場進(jìn)行定期細(xì)菌藥敏監(jiān)測，為臨床用藥提供數(shù)據(jù)支撐與指導(dǎo)。

［1］Oliveira S， Pijoan C. Haemophilus parasuis : new trends on diagnosis， epidemiology and control［J］.Vet Microbiol，2004， 99（1）: l-12.

［2］胡軍勇， 湯細(xì)彪， 湯電， 等. 臨床分離豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌多重耐藥性監(jiān)測［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2012， （5）: 623-628.

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ISOLATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF HAEMOPHILUS PARASUIS IN SHANGHAI

ZHANG Yue， LI Bei-bei， WEI Jian-chao， SHAO Dong-hua， LIU Ke， SHI Yuan-yuan，QIU Ya-feng， MA Zhi-yong
（ Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，China）

The aim of this study was to investigate antibiotic resistance in Haemophilus parasuis isolates in Shanghai and thereby to provide data support for antibiotc use in clinical and prevention of H. parasuis infection. 62 H. parasuis were isolated from 484 samples. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of 21 antibiotics were determined by agar dilution method. Susceptibility test showed that all isolates were susceptible to azithromycin， tilmicosin， tiamulin， amikacin， ceftiofur and levofloxacin. At least 90% of them were susceptible to erythromycin （60， 96.8%）， florfenicol（59， 95.3%）， chloramphenicol（60， 96.8%）， gentamicin （60， 96.8%）， spectinomycin（61， 98.4%）， penicillin （57，91.9%）， ampicillin （57， 91.9%） and ciprofloxacin （61， 98.4%）. Resistance to tetracycline and enrofloxacin were found in 75.8% （47） and 30.6% （19） of the isolates， respectively. Resistance to at least 2 antibiotics was observed in 37.1% of the isolates. The results of this study indicated that antibiotic resistance in H.parasuis isolates of Shanghai was not too severe. However， resistance to some antibiotics has emerged and enhanced， and continued efforts are needed to monitor the drug susceptibility of the H. parasuis isolates.

Haemophilus parasuis； antibacterial drugs； antibiotic resistance； swine

S852.612

A

1674-6422（2015）04-0025-06

2015-03-20

國家自然科學(xué)基金項目（31302145）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目

張悅，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馬志永，E-mail: zhiyongma@shvri.ac.cn