王建業(yè)，黃 鈺，段進(jìn)坤，朱國(guó)強(qiáng)

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

鵝細(xì)小病毒鵝胚化疫苗株 SYG61v 對(duì)雛鵝毒力減弱的遺傳基礎(chǔ)分析

王建業(yè)，黃 鈺，段進(jìn)坤，朱國(guó)強(qiáng)

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

本研究對(duì)鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）SYG61v弱毒疫苗株與5個(gè)分離于不同年代的GPV強(qiáng)毒株，在編碼蛋白氨基酸序列及非編碼調(diào)控區(qū)堿基序列進(jìn)行了比對(duì)，確定了SYG61v的特征性突變位點(diǎn)，而5個(gè)強(qiáng)毒株中這些位點(diǎn)均高度保守。SYG61v株的VP1和Rep1蛋白，分別產(chǎn)生了11個(gè)和10個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變。Rep1的10個(gè)突變氨基酸中，7個(gè)均處于Rep1蛋白羧基端的100個(gè)氨基酸范圍內(nèi)，而VP1蛋白中的10個(gè)突變氨基酸中，推測(cè)僅有1個(gè)位點(diǎn)處于病毒衣殼表面。在左側(cè)末端倒置重復(fù)序列（inverted terminal repeat， ITR）與P9啟動(dòng)子之間非編碼區(qū)，存在兩段共7個(gè)堿基的連續(xù)堿基突變。SYG61v弱毒株中突變位點(diǎn)的確認(rèn)為進(jìn)一步明確他們各自在弱毒株毒力減弱中的作用奠定了基礎(chǔ)。

疫苗株；強(qiáng)毒株；突變；毒力減弱；序列比對(duì)

小鵝瘟（gosling plague，GP）是由鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）所引起的雛鵝的一種急性或亞急性的敗血性傳染病，是當(dāng)前養(yǎng)鵝業(yè)一種重要疫病，10日齡左右的雛鵝感染GPV后具有很高發(fā)病率和死亡率［1］。小鵝瘟的預(yù)防多采用主動(dòng)免疫，當(dāng)前可使用的疫苗為致弱的鵝細(xì)小病毒活疫苗，包括種鵝用的活疫苗和雛鵝用的活疫苗。種鵝開(kāi)產(chǎn)前2周左右接種，后代雛鵝可因卵黃中母源抗體而獲得被動(dòng)保護(hù)。雛鵝用的活疫苗可供1日齡雛鵝使用，使雛鵝在接觸野毒之前建立積極的主動(dòng)免疫［2］。這兩種活疫苗制劑均獲得我國(guó)新獸藥證書許可。

方定一等［3］1961年分離了1個(gè)GPV強(qiáng)毒株，命名為SYG61，在鵝胚上盲傳適應(yīng)后對(duì)雛鵝毒力開(kāi)始減弱。供雛鵝使用的疫苗株為鵝胚上傳至50代次以上的毒株，該毒株對(duì)雛鵝已完全失去致病性［4］，為區(qū)分于其親本強(qiáng)毒株，將致弱的疫苗毒株命名為SYG61v。本研究對(duì)弱毒株［5］與強(qiáng)毒株之間在核苷酸和氨基酸水平進(jìn)行了全面的比較分析，確認(rèn)了在弱毒株與強(qiáng)毒株之間存在的特征性差異位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在SYG61v對(duì)雛鵝的毒力減弱中不能發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 毒株來(lái)源 擬用于序列比對(duì)分析的毒株全基因組均已測(cè)定并公開(kāi)報(bào)道。B株為匈牙利1967年分離的強(qiáng)毒株［6］；82-0321和06-0329為我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的強(qiáng)毒分離株［7］；YZ99-6和LH株為本實(shí)驗(yàn)室分別于1999年和2012年分離于揚(yáng)州市周邊地區(qū)的強(qiáng)毒株［8］；SYG61v為本實(shí)驗(yàn)室保存的GPV鵝胚化疫苗株，已在鵝胚上傳代50次以上，也是目前國(guó)內(nèi)唯一批準(zhǔn)可以在雛鵝上使用的疫苗株。所列毒株的基因組序列信息，見(jiàn)表1。

表1 用于序列比對(duì)的鵝細(xì)小病毒分離株遺傳背景及基因組特征Table 1 GPV strains used in this study for comparison

1.2 生物軟件分析 采用DNASATR 7.1軟件包中的MegAlign程序?qū)YG61V弱毒株與其他5個(gè)GPV強(qiáng)毒株基因組的堿基序列以及編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。采用在線糖基化分析軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對(duì)潛在的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 VP1蛋白的氨基酸比對(duì) 氨基酸序列比對(duì)表明SYG61v的VP1蛋白共有11處氨基酸位點(diǎn)與GPV強(qiáng)毒株存在差異，而在這些氨基酸位點(diǎn)，所有強(qiáng)毒株均高度保守（圖1）。SYG61v的突變氨基酸位點(diǎn)分別為N49S、Q116R、P143S、V144I、A149V、S178T、 N265T、F476L、H637Y、T672S、V718I。其中有4個(gè)氨基酸突變分布于VP1蛋白的N端獨(dú)特區(qū)，2個(gè)氨基酸突變存在于VP2蛋白氨基端，在VP3蛋白中共有5處氨基酸突變。

2.2 Rep1蛋白的氨基酸比對(duì) 對(duì)Rep1蛋白的氨基酸比對(duì)分析表明SYG61v與強(qiáng)毒株之間共有10處氨基酸位點(diǎn)存在差異，而所有強(qiáng)毒株在這些位點(diǎn)均高度保守（圖2）。這些突變位點(diǎn)是N35T、T181S、A182P、S535A、Q544E、E576D、K579E、Y592C、A602T和N609D，大多分布于Rep蛋白的羧基端，在Rep蛋白總共627個(gè)氨基酸中，近羧基端有7處突變，另外3處突變位于氨基端。

圖 1 SYG61v 疫苗株和 5 個(gè)鵝細(xì)小病毒強(qiáng)毒株的 VP1 蛋白氨基酸序列的比對(duì)分析Fig. 1 Alignment of amino acid sequences of VP1 proteins of the vaccine strain SYG61v and five GPV virulent strains

圖 2 SYG61v 疫苗株和 5 個(gè)鵝細(xì)小病毒強(qiáng)毒株之間Rep 蛋白氨基酸序列的比對(duì)分析Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of Rep proteins of the vaccine strain SYG61v and five GPV virulent strains

2.3 編碼蛋白糖基化位點(diǎn)分析 糖基化位點(diǎn)分析表明強(qiáng)毒株和疫苗株的Rep1和VP1蛋白各自擁有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，但這些位點(diǎn)與強(qiáng)弱毒株的差異氨基酸位點(diǎn)均不重合。

2.4 P9啟動(dòng)子區(qū)的比對(duì) P9啟動(dòng)子調(diào)控Rep基因的表達(dá)，P9啟動(dòng)子區(qū)上游緊臨5?端末倒置重復(fù)序列（inverted terminal repeat， ITR）。核苷酸序列比對(duì)分析表明與5個(gè)強(qiáng)毒株序列相比，SYG61v在P9啟動(dòng)子附近存在9處堿基突變，其中2個(gè)堿基突變?cè)赑9啟動(dòng)子（TATAA序列）下游、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游。最具特征的變動(dòng)是在P9啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（ATF/CREB）之間存在兩段連續(xù)的堿基突變，分別由強(qiáng)毒株的“GCAAT”和“CA”突變?yōu)槿醵局甑摹癟AGGG”和“TG”（圖3）。

2.5 ITR的比對(duì)分析 SYG61V弱毒株的5?和3?端ITR均有442個(gè)堿基組成。與B株相比，除了5?端ITR在Bubble區(qū)的突出環(huán)部缺失1個(gè)堿基外，其他位置未見(jiàn)缺失，強(qiáng)毒株YZ99-6和LH在該位置也同樣缺失1個(gè)堿基。SYG61v在ITR發(fā)生了多處突變，其中在發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖部存在24個(gè)堿基突變（圖4），在D區(qū)存在2個(gè)堿基突變，不過(guò)這些突變均成對(duì)發(fā)生，突變后的堿基依然能夠配對(duì)，D區(qū)和D '區(qū)的2個(gè)突變堿基也能夠互補(bǔ)，因此對(duì)ITR回文結(jié)構(gòu)的形成不產(chǎn)生影響。

3 討論

圖 3 SYG61v 弱毒株與鵝細(xì)小病毒強(qiáng)毒株的 P9 啟動(dòng)子區(qū)核苷酸序列比對(duì)分析Fig. 3 Alignment of nucleotide sequences spanning from the 5' ITR to the P9 promoter among the SYG61v and five GPV virulent strains

圖 4 SYG61v 弱毒株基因組左側(cè)末端倒置重復(fù)（inverted terminal repeat， ITR）序列（A）和右側(cè)ITR序列（B）Fig. 4 Sequences of the left inverted terminal repeats （A） and the right inverted terminal repeats （B） of the vaccine strain SYG61v

在組成GPV衣殼的3種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP3蛋白豐度最高。依據(jù)對(duì)腺相關(guān)病毒2型（AAV-2）病毒粒子的晶體結(jié)構(gòu)分析，大致有9個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域突出于病毒衣殼的表面，其中8個(gè)位于VP3蛋白［9-11］，這些結(jié)構(gòu)域也是最可能與宿主受體相結(jié)合的區(qū)域。在SYG61v與強(qiáng)毒株之間存在的總共11個(gè)差異氨基酸中，僅有5個(gè)氨基酸突變存在于VP3蛋白中，這5個(gè)突變氨基酸中，僅有1個(gè)突變（F476L）可能產(chǎn)生于衣殼表面，其他突變位點(diǎn)或者不在這些區(qū)域范圍內(nèi)，或者毗鄰這些區(qū)域，因此F476L突變位點(diǎn)在SYG61v弱毒株毒力減弱中的作用值得進(jìn)一步深入探究。VP1蛋白氨基端獨(dú)特區(qū)（VP1u）由145個(gè)氨基酸組成，該區(qū)域被證實(shí)具有磷脂酶活性，與成熟病毒粒子感染性有關(guān)［12，13］，SYG61v弱毒株在此處發(fā)生了4處突變，這些突變位點(diǎn)在SYG61v病毒株對(duì)雛鵝毒力減弱中的作用有待進(jìn)一步分析。

Rep蛋白具有DNA結(jié)合能力，能夠與ITR特定序列結(jié)合，參與病毒基因組復(fù)制進(jìn)程［14，15］。Rep蛋白還能夠反式作用于P40啟動(dòng)子，調(diào)控結(jié)構(gòu)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［16，17］。Rep基因的羧基端分布多個(gè)重要元件，如P40啟動(dòng)子，mRNA剪接的donor位點(diǎn)和acceptor位點(diǎn)，ATP和NLS結(jié)合位點(diǎn)以及鋅指結(jié)合域［11，18］。SYG61v弱毒株與其他強(qiáng)毒株之間相比，Rep蛋白共發(fā)生了10處氨基酸突變，其中7個(gè)處于羧基端的100個(gè)氨基酸范圍內(nèi)，集中于這一區(qū)域的突變位點(diǎn)在SYG61v對(duì)雛鵝毒力減弱中是否扮演重要角色值得進(jìn)一步深入研究。

GPV擁有細(xì)小病毒科成員中最長(zhǎng)的ITR序列［19］，SYG61v傳代致弱過(guò)程中在ITR區(qū)累積了20多個(gè)堿基突變，但分析表明這些突變不影響堿基在回文區(qū)莖部的配對(duì)以及D和D區(qū)序列的配對(duì)，對(duì)基因組通過(guò)DD配對(duì)從而形成更大范圍的回文并無(wú)阻礙，因此對(duì)病毒基因組復(fù)制不會(huì)產(chǎn)生任何影響。而在ITR下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)到P9啟動(dòng)子之間，SYG61v存在連續(xù)的堿基突變，這些突變堿基在病毒致弱過(guò)程中生物學(xué)意義有待研究。

由于距離SYG61最初分離時(shí)間已過(guò)去50余年，加上當(dāng)時(shí)科研條件制約，早期代次的強(qiáng)毒株已經(jīng)丟失，因此簡(jiǎn)單的在SYG61V疫苗株與其親本強(qiáng)毒株之間進(jìn)行序列比對(duì)已經(jīng)不可能。本研究選取用于比較的強(qiáng)毒株來(lái)自不同地區(qū)和年代，具有充分的代表性，包括了與SYG61分離年代很近的B株。通過(guò)強(qiáng)弱毒株間的比對(duì)，確定了在編碼蛋白和調(diào)控區(qū)存在的特征性氨基酸和堿基突變，這些突變?cè)赟YG61v的致弱過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，累積的位點(diǎn)突變促使SYG61由對(duì)雛鵝致病的強(qiáng)毒株轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)雛鵝失去致病性的疫苗株。但所有這些突變中，哪些氨基酸位點(diǎn)或堿基起關(guān)鍵作用尚待進(jìn)一步驗(yàn)證，而構(gòu)建GPV感染性克隆將是解決這一問(wèn)題的有效手段，相關(guān)研究正在開(kāi)展中。

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ANALYSIS OF THE GENETIC BASIS DETERMINING THE ATTENUATION OF A GOOSE EMBRYO-ADAPTED VACCINE STRAIN SYG61v OF GOOSE PARVOVIRUS

WANG Jian-ye， HUANG Yu， DUAN Jin-kun， ZHU Guo-qiang
（Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

s:In the present study， the amino acid sequences of the coding proteins and non-coding nucleotide sequences were compared between the attenuated vaccine strain SYG61v and five virulent strains of Goose parvovirus （GPV） with various isolation years. The typical amino acids and nucleotides alterations in SYG61v were identified， while all of these sites were conserved for five virulent strains. Eleven and ten amino acid mutations occurred in the VP1 and Rep1 protein， respectively. Within the 10 mutated amino acids for the Rep1 protein of SYG61v， seven were observed in the scope of carboxyl terminal 100 amino acids， and only one mutation site in the VP1 protein was believed to lie in the surface domain of viral capsid. In the non-coding region between the left inverted terminal repeat（ITR） and P9 promoter， two places of consecutive nucleotide mutations were found in the SYG61v. Identification of the mutations sites in the SYG61v strain could help to further explore which site alterations actually contribute the attenuation of the virulent GPV after adaptive passages in the eggs.

S852.659.2

A

1674-6422（2015）04-0019-06

2015-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31172317）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

王建業(yè)，男，副教授，主要從事水禽病毒病研究

王建業(yè)，E-mail:wangjy@yzu.edu.cn