阮寶陽，王 林，宮曉倩，汪秀會，劉曉敏，汪 琪，單同領(lǐng)，李澤君，劉芹防，陳鴻軍，滕巧泱，童光志，于 海

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271000）

H1N1 亞型豬流感病毒 HA1 基因原核表達(dá)及鑒定

阮寶陽1，2，王 林2，宮曉倩1，汪秀會1，劉曉敏1，汪 琪1，單同領(lǐng)1，李澤君1，劉芹防1，陳鴻軍1，滕巧泱1，童光志1，于 海1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271000）

本研究利用RT-PCR技術(shù)擴增禽源H1N1亞型豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）的HA1基因片段，將其連接至pCold-TF載體上，菌液鑒定為陽性的克隆經(jīng)測序驗證正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至高表達(dá)的表達(dá)宿主菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)并大量表達(dá)目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過純化及SDS-PAGE電泳分析，表明重組蛋白以可溶性形式在上清中大量表達(dá)，大小約90 kDa，且在 15℃、0.8mmol/L IPTG 條件下誘導(dǎo) 24 h 表達(dá)效果最好。通過 Ni 柱純化后，經(jīng) Western blot 分析表明重組表達(dá)的蛋白能與禽源 H1N1 亞型 SIV 陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有較好的反應(yīng)原性。

HA1 基因；禽源 H1N1 亞型豬流感病毒；原核表達(dá)；可溶性；抗原性

豬流感病毒（Swine infiuenza virus，SIV）屬于正粘病毒、A型流感病毒屬的分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，是引起豬呼吸道疾病的一種重要病原體。豬流感（swine influenza，SI）很少直接引起死亡，但多與其他疾病，如豬繁殖與呼吸障礙綜合征、傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌等并發(fā)或繼發(fā)感染，使病情復(fù)雜化和嚴(yán)重化，導(dǎo)致死亡率升高。研究發(fā)現(xiàn)豬的呼吸道上皮細(xì)胞同時具有禽流感病毒受體和人流感病毒受體［1，2］，因此豬被稱為新型流感病毒產(chǎn)生的“混合器”和流感病毒跨越種間宿主屏障的重要“中間宿主”［3，4］。

HA蛋白是介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面結(jié)合的主要成分，是流感最重要的保護(hù)性抗原。它是由3個血凝素蛋白聚合在一起形成的三聚體結(jié)構(gòu)，呈頭莖結(jié)構(gòu)，其中頭部由HA1亞單位組成，是重要的病毒受體結(jié)合位點和抗原決定簇區(qū)域［5］，而HA2是HA基因的高度保守區(qū)域［5，6］。本研究通過開展構(gòu)建禽源H1N1亞型SIV的HA1蛋白原核表達(dá)及抗原性分析的研究，為進(jìn)一步建立間接 ELISA 檢測方法提供基礎(chǔ)材料，并為防控SI提供有力的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 病毒株 禽源H1N1亞型SIV分離株A/Swine/ Shanghai/1/2014（H1N1）由本實驗室分離、鑒定和保存。病毒在 MDCK 細(xì)胞上增殖，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯病變效應(yīng)（cytopathic effect， CPE）后，收集細(xì)胞上清備用。

1.2 菌株、載體及主要試劑 克隆宿主菌DH5α、表達(dá)宿主菌BL21（DE-3）購自天根生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pCold-TF由本實驗室保存；IPTG購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶 Sac I 和 Xba I 購自大連寶生物工程有限公司；病毒RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；引物由駿生物公司合成；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG購自北京中杉金橋生物公司；6～8周齡雌性BALB/c老鼠購自斯萊克實驗動物有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)禽源H1N1亞型SIV的HA1基因序列，設(shè)計一對特異性引物，并加上有效的酶切位點和保護(hù)性堿基。上游引物：CGAGCTCGACA CCATTTGTGTAGGC；下游引物：GCTCTAGATCT GGATTGAATAGAGGG（下劃線是限制性內(nèi)切酶Sac I和Xba I 酶切位點，加在前面的是保護(hù)性堿基）。

1.4病毒RNA提取及目的基因的RT-PCR擴增 按TRlzol試劑盒使用說明書提取病毒RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過RT-PCR進(jìn)行目的片段HA1的擴增，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性20 s，48℃退火20s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃再延伸10min。擴增后的核酸產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進(jìn)行產(chǎn)物回收。

1.5 HA1基因的克隆和重組表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-HA1的構(gòu)建 將HA1基因的PCR產(chǎn)物膠回收后經(jīng)Sac I 和Xba I 雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，克隆至 pCold-TF 載體中，菌液經(jīng) PCR 鑒定，陽性菌液送英駿生物公司測序。將測序正確的陽性菌液擴增，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pCold TF-HA1。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及 SDS-PAGE 分析 挑取單菌落在37℃、200 r/min 水平搖床上增菌培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度活化至OD600達(dá)0.6左右，加入不同濃度的IPTG，將菌液轉(zhuǎn)入15℃、200 r/min 水平搖床上，不同時間點收集菌液，經(jīng)SDS-PAGE 分析，確定IPTG 的最佳誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時間。

1.7 重組蛋白的純化 將大量增殖的菌液10 000×g 離心10 min，棄上清；按照25:1 的體積比用冰浴預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重懸菌體，加入蛋白酶抑制劑，進(jìn)行超聲破碎；將裂解產(chǎn)物14000×g離心20 min，分離上清和沉淀，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，收集的上清液按照His-Tag融合蛋白純化操作手冊進(jìn)行重組蛋白的純化。

1.8 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素（NC）膜，用5%脫脂奶粉封閉1h；H1N1亞型SIV的小鼠陽性血清作為一抗，4℃搖床上孵育過夜，用PBST漂洗纖維素膜3次，每次10 min；以辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG為二抗，常溫孵育1.5h，PBST漂洗纖維素膜3次，每次10 min，最后經(jīng)ECL發(fā)光試劑發(fā)光后暗室顯影成像。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增及重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-HA1的構(gòu)建 通過RT-PCR擴增HA1片段，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示片段大小為981bp，與目的片段大小一致（圖1）。通過PCR對菌液鑒定后（圖2），將陽性的菌液送去測序，結(jié)果顯示HA1正確連接到pCold TF載體上。

圖1 HA1基因 RT-PCR 擴增產(chǎn)物Fig.1 The RT-PCR products of HA1 gene

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pCold TF-HA1 的菌液鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasma pCold TF-HA1 in E.coli

2.2 轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)和重組蛋白的SDS-PAGE 分析經(jīng)過大量誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎菌液，分離得到的上清和沉淀進(jìn)行8% SDS-PAGE 鑒定，結(jié)果表明重組目的蛋白大部分以可溶性的上清形式存在，以包涵體形式表達(dá)很少（圖3）。IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)時間為24 h（圖3），可以大量表達(dá)目的蛋白，表達(dá)的蛋白大小約90kDa，其中目的蛋白約36 kDa，標(biāo)簽蛋白大小約52 kDa，與預(yù)期結(jié)果相一致。

圖 3 重組蛋白表達(dá)可溶性分析Fig. 3 Soluble analysis of recombinant HAI protein in E.coli

2.3 重組蛋白的純化 表達(dá)出的可溶性蛋白通過Ni柱純化，用1×Ni-NTA漂洗緩沖液連續(xù)漂洗4次，洗脫液分別做SDS-PAGE分析（圖4），結(jié)果表明目的蛋白已被純化。

圖 4 重組蛋白的純化Fig.4 The purification of recombinant protein

2.4 重組蛋白的 Western blot 分析 以H1N1亞型SIV的鼠陽性血清作為一抗，進(jìn)行Western blot反應(yīng)時出現(xiàn)明顯條帶，而以陰性血清作為一抗沒有出現(xiàn)條帶，同樣誘導(dǎo)空載體表達(dá)蛋白與陰性、陽性血清進(jìn)行蛋白免疫印跡反應(yīng)均沒有出現(xiàn)條帶（圖5）。可見重組目的蛋白具有良好的特異性。

圖 5 重組蛋白 的 Western blot 分析Fig.5 Western blot analysis of the recombinant protein

3 討論

雖然SIV感染豬導(dǎo)致的死亡率低，但是發(fā)病率高，而且極易引起其他病毒和細(xì)菌的混合感染［7］，使疫情變得更為復(fù)雜。目前H1NI亞型流感病毒在我國的豬群中常年流行［8］。2007年，起源于歐洲的禽源H1NI亞型SIV在我國豬群中被發(fā)現(xiàn)，隨后在國內(nèi)豬群中廣泛流行［9］，這些病原在豬群中通過基因重組產(chǎn)生新的SIV基因型，其分布和進(jìn)化也越來越復(fù)雜。我國擁有全球60%以上的豬群養(yǎng)殖，龐大的豬群與傳統(tǒng)的畜禽混養(yǎng)的養(yǎng)殖模式都為新亞型或新基因型流感病毒的產(chǎn)生提供了機會［10］，因此加強對豬群中禽源H1N1亞型SIV的檢測并及時掌握SI流行規(guī)律意義重大。

本研究中原核表達(dá)的HA1蛋白大多以上清可溶形式表達(dá)，包含了原有蛋白的部分空間構(gòu)象，具有較好的免疫原性［11］。同時帶有His標(biāo)簽的重組蛋白通過Ni柱純化后可得到大量純化的蛋白，這為蛋白的純化提供方便。Western blot 結(jié)果表明，重組的HA1蛋白與禽源H1N1亞型SIV免疫小鼠所制備的陽性血清反應(yīng)明顯，作為一抗的陽性血清稀釋5000倍后仍然能顯現(xiàn)出明顯的陽性條帶，表明重組得到HA1蛋白具有很強的特異性。由于HA1是HA蛋白重要的病毒受體結(jié)合位點和抗原決定簇區(qū)域，因此研究流感病毒的HA1位點的抗原性在疫苗的研究和發(fā)展中具有重要意義［12］。同時重組的蛋白可以用于SI抗體水平的檢測，為今后建立檢測豬流感抗體的間接ELISA方法奠定了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)［13］。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND ANTIGENIC ANALYSIS OF HA1 GENE OF AVIAN-LIKE H1N1 SUBTYPE SWINE INFLUENZA VIRUS

RUAN Bao-yang1，2， WANG Lin2， GONG Xiao-qian1， WANG Xiu-hui1， LIU Xiao-min1，WANG Qi1，SHAN Tong-ling1， LI Ze-jun1， LIU Qin-fang1， TENG Qiao-yang， CHEN Hong-jun1，
TONG Guang-zhi1， YU Hai1
（1.Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 2002411， China； 2.College of Veterinary Medicine，Shandong Agricultural University， Taian 271000， China）

To express HA1 protein of H1N1 Subtype Swine influenza virus（SIV）， the HA1 gene was amplified by RT-PCR and cloned into vector pCold-TF. After being sequenced， the recombinant plasmid was transformed into expression host strain DL21（DE3） then IPTG was added to induce expression. The expressed HA1 fusion protein was purified by Nickel colum and analyzed by SDS-PAGE. The results indicated that recombinant protein was expressed in soluble condition in the supernatant and was about 90 kDa in size. The optimum condition for the expression was that the bacteria was induced for 24 h under the conditions （15℃ and 0.8m mol/L IPTG）. The result in Western blot of purified recombinant protein showed that the HA1 protein had good antigenicity， and could berecognized by SIV positive serum.

HA1 gene； H1N1 subtype Swine influenza virus（SIV）；prokaryotic expression； soluble； antigenicity

S852.659.5

A

1674-6422 （2015）04-0014-05

2014-04-09

國家青年自然科學(xué)基金（31201916）；上海市自然科學(xué)基金青年項目（12ZR1453500）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目（2015JB07）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程科研團(tuán)隊“動物流感病毒病原生態(tài)學(xué)”項目

阮寶陽，男，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

童光志， E-mail：gztong@shvri.ac.cn；于海， E-mail：haiyu@shvri.ac.cn