常曉敬

(盧龍縣職業(yè)技術(shù)教育中心，河北秦皇島066400)

為了解河北省仔豬源大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥質(zhì)粒的分布情況，本試驗(yàn)運(yùn)用K-B 法對(duì)分離自河北省十個(gè)不同市縣的已經(jīng)過系統(tǒng)鑒定和致病性檢驗(yàn)的40 株仔豬源大腸桿菌進(jìn)行了22種常見抗菌藥的藥敏試驗(yàn)，并提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒譜型分析，初步探討大腸桿菌耐藥性與質(zhì)粒圖譜之間的關(guān)系。結(jié)果顯示:40 株菌均為多重耐藥菌株，6 耐和7 耐的居多，占了總數(shù)的42.5%，其中對(duì)氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥率較高，分別達(dá)到了95%，87.5%，85%和72.5%；對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氯霉素和強(qiáng)力霉素耐藥率也達(dá)到了40%以上。

1 緒論

由腸毒素性大腸桿菌引起的仔豬腹瀉在我國及世界各地均有發(fā)生，每年死亡的仔豬中約有50%與此有關(guān)。隨著養(yǎng)豬業(yè)向規(guī)?；l(fā)展，飼養(yǎng)密度不斷增加，仔豬大腸桿菌性腹瀉有明顯上升的趨勢(shì)，我國大多數(shù)省、市、自治區(qū)均有不同程度的發(fā)生與流行，該病已成為養(yǎng)豬業(yè)一個(gè)有重要經(jīng)濟(jì)意義的疾病。目前，對(duì)于仔豬大腸桿菌性腹瀉病的防治主要是以注射疫苗以及應(yīng)用抗菌藥物為主要手段，但隨著抗菌藥物長(zhǎng)期大量廣泛應(yīng)用，大腸桿菌耐藥株不斷出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，使得大腸桿菌病成了疫病防制中的一大難題，嚴(yán)重困擾著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。為控制大腸桿菌耐藥性的蔓延，加強(qiáng)對(duì)沙門氏菌耐藥性的監(jiān)測(cè)力度和大腸桿菌耐藥機(jī)制的研究迫在眉睫。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)菌株

來自河北省邯鄲市、秦皇島昌黎縣、秦皇島撫寧縣、張家口市等幾個(gè)不同市縣的已經(jīng)過系統(tǒng)鑒定和致病性檢驗(yàn)的豬源大腸桿菌20 株。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株

大腸桿菌ATCC25922 由本校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

2.1.3 培養(yǎng)基及藥品試劑

Mue11er-Hinton（MH）培養(yǎng)基、LB 肉湯、入DNA/HindⅢ、瓊脂糖、TAE、凝膠載樣緩沖液、22種藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；相關(guān)試劑配置均按常規(guī)方法配置。

2.1.4 儀器

TGL-16 型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO－BEST200E），美國西盟生產(chǎn)；凈化工作臺(tái)（SW-CJ-ZFD 雙人單面），蘇凈集團(tuán)安泰公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-103B），上海智城分析儀器制造有限公司等。

2.2 抗生素敏感性試驗(yàn)

采用NCCLS 推薦的瓊脂擴(kuò)散法（K-B）測(cè)定已經(jīng)生化鑒定和致病性檢驗(yàn)的40 株豬源大腸桿菌對(duì)22 種常用抗菌類藥物的敏感性。從培養(yǎng)了16～24 小時(shí)的麥康凱瓊脂平板上，挑出單個(gè)菌落，直接用生理鹽水制成0.5 麥?zhǔn)蠁挝?。?5 分鐘內(nèi)，用無菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，在MH 瓊脂培養(yǎng)基表面涂布接種，將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面。紙片一旦與平板接觸，不應(yīng)再移動(dòng)。37℃培養(yǎng)18～20 小時(shí)以后，測(cè)量各藥敏紙片抑菌圈直徑，同時(shí)以大腸桿菌ATCC25922 進(jìn)行質(zhì)控。參照NCCLS（2009）公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感、中介、耐藥三種形式對(duì)抑菌圈作出判定，個(gè)別NCCLS（2009）沒有列出但我國人醫(yī)或獸醫(yī)仍使用的藥物按杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)解釋，見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)果與分析

3.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

20 株致病性大腸桿菌對(duì)7 種臨床常用藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。20 菌株中對(duì)氨芐西林、阿莫西林、復(fù)方新諾明耐藥率較高，分別達(dá)到了95%，87.5%和72.5%；對(duì)頭孢菌素類藥物的耐藥率低于10%。

表2 20 株豬源大腸桿菌的耐藥情況

3.2 大腸桿菌的耐藥譜及多重耐藥情況

20 株豬源大腸桿菌對(duì)7 種藥物的耐藥譜及多重耐藥性情況可看出：20 株豬源大腸桿菌分離株共有26 種耐藥譜，耐藥譜完全相同的分離株最多4 株，大多數(shù)分離株都具有不同的耐藥譜。

可知20 株大腸桿菌分離株均為多重耐藥菌株，平均每株菌耐藥5～6 種，最少為2 種，最多為10 種，6 耐和7 耐的居多，占了總數(shù)的42.5%，這與一些抗菌藥物在生產(chǎn)中的長(zhǎng)期使用有關(guān)。

4 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)中，臨床分離的20 株仔豬源大腸桿菌均為耐藥菌，共有26 種耐藥譜。這些耐藥菌株中，無單耐菌株。6 耐和7 耐的居多，占了總數(shù)的42.5%，耐藥性產(chǎn)生嚴(yán)重的抗生素是磺胺類藥物、四環(huán)素類、青霉素類藥物，耐藥率達(dá)到了70%以上，說明仔豬源大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為主，且耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重和普遍。這與養(yǎng)豬場(chǎng)在豬病預(yù)防治療上使用以上抗生素，并在飼料中長(zhǎng)期添加四環(huán)素類、阿莫西林等青霉素類抗生素有著密切的聯(lián)系。張鐵等（2005）從河北、北京、天津地區(qū)發(fā)生仔豬黃、白痢的十個(gè)豬場(chǎng)分離60 株大腸桿菌，對(duì)其耐藥性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)與分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：耐藥率較高的分別為鏈霉素(80%)、慶大霉素(53.3%)、氨芐青霉素(75%)、復(fù)方新諾明(86.7%)、痢菌凈(76.7%)、呋喃唑酮(71.2%)、諾氟沙星、環(huán)丙沙星(51.7%)、喹乙醇(75%)和洛美殺星(70%)氟苯尼考(55%).60 株大腸桿菌多數(shù)為6 耐以上的菌株(80%),其中8 耐、10 耐、6 耐最高分別為17%、15%、12%。邢艷蘋等（2010）對(duì)吉林分離出的113 株動(dòng)物源性大腸桿菌耐藥性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：113 株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥譜廣，且多表現(xiàn)為多重耐藥。大腸桿菌具有廣泛的耐藥性，推測(cè)這種現(xiàn)象的原因可能是：①我國養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物使用不規(guī)范，存在盲目性，正常大腸桿菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)性增強(qiáng)，易產(chǎn)生耐藥性。②耐藥質(zhì)粒在細(xì)菌間的水平傳播也是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要原因。耐藥質(zhì)?？删幋a細(xì)菌對(duì)藥物的耐藥性，耐藥質(zhì)粒可以在不同的細(xì)菌之間傳遞，通過耐藥質(zhì)粒的傳遞，耐藥基因也就完成細(xì)菌間的廣泛傳播。