申安 樊青義 趙雨晴 王燕敏 古國領

(1.焦作市食品藥品檢驗所 河南 焦作 454001;2.鄭州通泰醫(yī)藥科技有限公司 河南 鄭州 450001;3.國藥集團容生制藥有限公司 河南 焦作 454950)

鹽酸氨溴索注射液是目前臨床廣泛應用、起效迅速、使用安全的祛痰藥，適用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性呼吸道疾病，如慢性支氣管炎急性加重、喘息性支氣管炎、支氣管擴張及支氣管哮喘的去痰治療，術后肺部并發(fā)癥的預防性治療，早產(chǎn)兒及新生兒呼吸窘迫癥的治療?！吨袊幍洹?010年版收載有鹽酸氨溴索及其口服制劑(口服溶液、片劑、膠囊和緩釋膠囊)［1］，對有關物質(zhì)做了限量規(guī)定，但對注射劑未作收載。通過查閱國外藥典標準及相關資料［2－3］，得知其中可能存在雜質(zhì)A(2－氨基－3，5－二溴苯基甲醇)、雜質(zhì)B(反式－4－［6，8－二溴－1，4－二氫喹唑啉－3(2H)］環(huán)己醇)、雜質(zhì)C(反式－4－［［(E)－2－氨基－3，5－二溴苯亞甲基］氨基］環(huán)己醇)、雜質(zhì)D(順式－4－［(2－氨基－3，5－二溴芐基)氨基］環(huán)己醇、雜質(zhì)E(2－氨基－3，5－二溴苯甲醛)。根據(jù)原料藥供應商提供的鹽酸氨溴索工藝流程圖分析原料藥生產(chǎn)工藝，雜質(zhì)E是生產(chǎn)鹽酸氨溴索的起始原料，又是氧化降解產(chǎn)物;雜質(zhì)B為降解產(chǎn)物;雜質(zhì)A是起始原料雜質(zhì)E引入的雜質(zhì);雜質(zhì)C為反應中間體;雜質(zhì)D為鹽酸氨溴索的異構體。經(jīng)以上分析，在鹽酸氨溴索原料藥的質(zhì)量得到控制后，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C和雜質(zhì)D不會在制劑過程中增加。本實驗對擬選擇的雜質(zhì)B和雜質(zhì)E測定方法進行了適用性研究，并對試驗樣品和參比樣品進行了對比試驗。

1 儀器與試藥

島津LC－10A高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測器。

鹽酸氨溴索對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100599－200502);雜質(zhì)A對照品(批號2008－01－31)、雜質(zhì)B對照品(批號2010－03－24)、雜質(zhì)C對照品(批號2010－01－27)、雜質(zhì)D對照品(批號2010－06－107，德國LGC Dr.Sabine Schroder Product Reiease);雜質(zhì)E(GR，Produot，lot:A0255146)。

鹽酸氨溴索注射液樣品(國藥集團容生制藥有限公司，規(guī)格:2 ml∶15 mg，批號11040821、11040921、11041021);參比樣品(天津藥物研究院藥業(yè)有限公司，商品名伊諾舒?，規(guī)格:2ml:15mg，批號028110);甲醇為色譜純，磷酸氫二銨、磷酸均為分析純、純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.5 mm，5μm);流動相:0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0)－甲醇(45∶55);流速為1.0 ml/min;檢測波長為250 nm和238 nm;柱溫:30℃;進樣量:20μl［2－4］。

2.2 系統(tǒng)適應性試驗 取鹽酸氨溴索對照品約5 mg，加甲醇0.2 ml溶解，再加甲醛溶液(1→100)40μl，搖勻，置60℃加熱5 min，氮氣吹干，殘渣加水5 ml溶解，得供試液①;取雜質(zhì)B約1 mg，加1 ml流動相溶解，得供試液②。將供試液①、①混勻，加流動相稀釋至20 ml，取20μl注入液相色譜儀，重復進樣6次。在上述色譜條件下，250 nm波長處檢測，鹽酸氨溴索峰與降解物質(zhì)(雜質(zhì)B)峰的分離度分別為6.029、6.038、5.748、6.045、5.983、5.807，理論塔板數(shù)以鹽酸氨溴索峰計分別為3 662、3 471、3 041、3 544、3 551、3 396，拖尾因子在0.970～0.982之間;分離度、理論板數(shù)及拖尾因子均符合要求。保留時間RSD分別為0.98%、0.83%，峰面積RSD分別為4.9%、5.0%，保留時間和峰面積的重復性良好。

2.3 有關物質(zhì)測定方法 精密量取本品適量(約相當于鹽酸氨溴索37.5 mg)，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。另取雜質(zhì)B［反式－4－(6，8－二溴－1，4－二氫喹唑啉－3H)環(huán)己醇，分子式C14H18Br2NO］對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含雜質(zhì)B約12μg的溶液，搖勻，精密量取適量，用流動相稀釋制成每1 ml含雜質(zhì)B約1.2μg的溶液，搖勻，作為雜質(zhì)B對照品溶液;另取雜質(zhì)E［2－氨基－3，5－二溴－苯甲醛，分子式C7H5Br2NO］對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含雜質(zhì)E約7.5μg的溶液，搖勻，精密量取適量，用流動相稀釋制成每1 ml含雜質(zhì)E約0.75μg的溶液，搖勻，作為雜質(zhì)E對照品溶液。在上述色譜條件下測定。

2.3.1 在250 nm波長處檢測 精密量取雜質(zhì)B對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液、對照溶液和雜質(zhì)B對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的4倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)B峰，按外標法以峰面積計算，雜質(zhì)B的含量不得過鹽酸氨溴索標示量的0.3%。除雜質(zhì)B和雜質(zhì)E以外，其他峰面積的和不得大于對照溶液色譜圖中主峰面積的0.4倍(0.4%)。

2.3.2 在238 nm波長處檢測 精密量取供試品溶液和雜質(zhì)E對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至雜質(zhì)E完全出峰。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)E峰，按外標法以峰面積計算，雜質(zhì)E的含量不得超過鹽酸氨溴索標示量的0.2%。

2.4 已知雜質(zhì)的分離

2.4.1 已知雜質(zhì)定位 精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E各適量，分別用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D約1μg的溶液;每1 ml中含雜質(zhì)B約3μg的溶液;每1 ml中含雜質(zhì)E約2μg的溶液。精密稱取鹽酸氨溴索適量，用流動相溶解制成每1 ml中含0.375 mg的溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，250 nm波長處檢測。試驗結果:雜質(zhì)A的保留時間約為7.641 min，雜質(zhì)B的保留時間約為9.271分鐘，雜質(zhì)C的保留時間約為11.466 min，雜質(zhì)D的保留時間約為6.675 min，雜質(zhì)E的保留時間約為11.146 min，鹽酸氨溴索保留時間約為5.803 min，對照品定位圖見圖1。

2.4.2 已知雜質(zhì)的分離 取鹽酸氨溴索、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E各適量，用流動相溶解制成每1ml中含鹽酸氨溴索0.375 mg，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D約1μg，雜質(zhì)B約3μg，雜質(zhì)E約2μg的混合溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，250 nm波長處檢測，圖譜及數(shù)據(jù)見圖2、表1。試驗結果:各色譜峰分離良好。

圖1 鹽酸氨溴索對照品定位圖譜

圖2 混合溶液圖譜

表1 混合溶液試驗數(shù)據(jù)

2.5 輔料干擾試驗 取鹽酸氨溴索注射液處方中輔料適量，用流動相溶解制成相當于含鹽酸氨溴索150μg/ml的輔料空白溶液，在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處檢測，圖譜見圖3。試驗結果表明，在色譜中5 min前有輔料峰和系統(tǒng)峰。

圖3 輔料干擾試驗圖譜

2.6 專屬性試驗 為驗證本試驗方法對相關降解產(chǎn)物的專屬性，對鹽酸氨溴索注射液分別進行酸、堿、高溫、光照、氧化等破壞試驗，考察降解產(chǎn)物與主成分及已知雜質(zhì)的分離情況，用來驗證擬定的有關物質(zhì)檢查方法的可行性。

2.6.1 破壞前供試品 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數(shù)據(jù)見圖4、表2。

2.6.2 堿破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加5 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，80℃水浴60 min，冷卻，用5 mol/L鹽酸溶液中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數(shù)據(jù)見圖5、表2。

2.6.3 酸破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加5 mol/L鹽酸溶液5 ml，80℃水浴60 min，冷卻，用5 mol/L氫氧化鈉溶液中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數(shù)據(jù)見圖6、表2。

2.6.4 高溫破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，置80℃水浴中8 h，冷卻，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數(shù)據(jù)見圖7、表2。

2.6.5 光照破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml無色量瓶中，置10 000 Lx強光下照射48 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數(shù)據(jù)見圖8、表2。

2.6.6 氧化破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加30%雙氧水5 ml，90℃水浴10 min，冷卻，加流動相稀釋至刻度，搖勻;另取水5 ml，同法操作，作為空白溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數(shù)據(jù)見圖9、表2。

試驗結果:本品對熱、酸穩(wěn)定，可被堿破壞，易被光照、氧化破壞。主峰與破壞產(chǎn)物峰分離良好。

圖4 破壞前供試品圖譜

圖5 堿破壞試驗圖譜

圖6 堿破壞試驗圖譜

圖7 高溫破壞試驗圖譜

圖8 光照破壞試驗圖譜

圖9 氧化破壞試驗圖譜

2.7 檢測限的測定 取鹽酸氨溴索對照品溶液，用流動相稀釋若干倍，進樣20μl，記錄主峰峰高約為基線在噪聲3倍時的色譜峰，測得鹽酸氨溴索的檢測限為0.755 2 ng。

2.8 耐用性試驗

2.8.1 波長變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將波長改變?yōu)?48 nm、250 nm、252 nm，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對波長進行微小變動，主峰與雜質(zhì)峰分離良好。

2.8.2 流速變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將流速改變?yōu)?.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對流速進行微小變動，主峰與雜質(zhì)峰分離良好。

表2 破壞試驗數(shù)據(jù)

2.8.3 流動相pH值變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將流速相水相的pH值改變3.8、4.0、4.2，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對流速進行微小變動，主峰與雜質(zhì)峰分離良好。

2.8.4 流動相組分比例變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將流動相組分比例改變?yōu)?7∶53、45∶55、43∶57，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對流動相組分比例進行微小變動，主峰與雜質(zhì)峰分離良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取鹽酸氨溴索注射液適量，加流動相稀釋制成濃度為0.375 mg/ml的溶液，于室溫放置，分別于0 h、4 h、8 h，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:本品供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 雜質(zhì)B檢測試驗

2.10.1 定量限試驗 精密稱取雜質(zhì)B對照品，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含0.01 mg的溶液。精密量取適量，用流動相稀釋制成雜質(zhì)B定量限溶液6份，各進樣20μl，250 nm波長處測定。計算雜質(zhì)B定量限為3.60 ng。

2.10.2 線性與范圍 精密量取雜質(zhì)B對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約為:0.1μg/ml、0.6μg/ml、1.0μg/ml、1.2μg/ml的供試液，各進樣20μl，250 nm波長處測定。以樣品濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，進行線性回歸得回歸方程:y=23 853x+943.93，相關系數(shù)r=0.998 7。結果:雜質(zhì)B的進樣量在3.6～23.9 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.10.3 精密度試驗 精密量取雜質(zhì)B對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約為1.2μg/ml的溶液，進樣20μl，250 nm波長處測定。重復試驗6次。計算峰面積的RSD為4.3%，測定結果的重復性良好。

2.10.4 準確度試驗 精密稱取鹽酸氨溴索適量，加流動相溶解制成0.375 mg/ml的溶液9份。精密稱取雜質(zhì)B對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含5μg/ml的溶液②。精密量取溶液②適量，加入鹽酸氨溴索溶液中，制成含雜質(zhì)B約1.0μg/ml、1.2μg/ml和1.4μg/ml的溶液各3份作為供試液，各進樣20μl，250 nm波長處測定。計算雜質(zhì)B的含量，各濃度的平均回收率在103.3%～109.4%，RSD為3.8%。

2.11 雜質(zhì)E檢測試驗

2.11.1 定量限試驗 精密稱取雜質(zhì)E對照品，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含2μg的溶液。精密量取適量，用流動相稀釋制成雜質(zhì)E定量限溶液6份，各進樣20μl，238 nm波長處測定。經(jīng)計算，雜質(zhì)E定量限為1.734 4 ng。

2.11.2 線性與范圍 精密量取雜質(zhì)E對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約:0.20μg/ml、0.35μg/ml、0.50μg/ml、0.75μg/ml的供試液，各進樣20μl，238 nm波長處測定。以樣品濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，進行線性回歸得回歸方程:y=37 208x+144.55，相關系數(shù)r=0.999 6。結果:雜質(zhì)E的進樣量在1.74～14.64 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.11.3 精密度試驗 精密量取雜質(zhì)E對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約為0.75μg/ml的溶液，進樣20μl，238 nm波長處測定。重復試驗6次。計算峰面積的RSD為3.9%，測定結果的重復性良好。

2.11.4 準確度試驗 精密稱取鹽酸氨溴索適量，加流動相溶解制成0.375 mg/ml的溶液9份。精密稱取雜質(zhì)E對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含1μg/ml的溶液②。精密量取溶液②適量，加入鹽酸氨溴索溶液中，制成含雜質(zhì)E約0.60μg/ml、0.75μg/ml和0.90μg/ml的溶液各3份作為供試液，各進樣20μl，238 nm波長處測定。計算雜質(zhì)E的含量，各濃度的平均回收率在9.64%～104.8%，RSD為3.9%。

2.12 樣品測定 按上述有關物質(zhì)檢查方法的色譜條件，測定樣品及參比樣品，檢查結果無明顯差異，結果見表3。

3 討論

鹽酸氨溴索原料中可能存在雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E。雜質(zhì)E是生產(chǎn)鹽酸氨溴索的起始原料，又是氧化降解產(chǎn)物;雜質(zhì)B為降解產(chǎn)物。通過專屬性破壞實驗，可以看到隨著鹽酸氨溴索的降解，雜質(zhì)B和雜質(zhì)E的含量發(fā)生明顯增加，所以應將這兩種雜質(zhì)作為控制鹽酸氨溴索注射液質(zhì)量的主要指標進行檢測。

表3 鹽酸氨溴索注射液有關物質(zhì)檢查結果(%)

通過查閱國外藥典標準及相關資料，選定了流動相的成分為0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0)和甲醇，兩種成分經(jīng)過篩選，確定了比例為45∶55。在此系統(tǒng)條件下，鹽酸氨溴索注射液的各種雜質(zhì)能夠進行良好的定位和分離，并且對主要檢測指標雜質(zhì)B和雜質(zhì)E檢測方法的驗證試驗結果滿意。方法學研究結果表明本方法簡便、快速、準確，可以用于鹽酸氨溴索注射液有關物質(zhì)的檢查。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:765－768.

［2］JX20030067.進口藥品注冊標準［S］.

［3］The Quality of Medicines of the Council of Europe.European pharmacopoeia［M］.4th ed.Germany:Druckerei C.H.Beck，Nordlingen，2002:625.

［4］紀傳俠，孟科，李雯，等.HPLC法測定注射用鹽酸氨溴索中的含量及有關物質(zhì)［J］.化工時刊，2008，22(4):40－42.