曹蒙 趙書君 郭歡歡 劉星爍 韓會會 張敏 李紅雨

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科 河南鄭州 450052)

上皮性卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科腫瘤首位。因缺乏早期診斷指標(biāo)，多數(shù)患者確診時已屬晚期，5年生存率不超過30%［1］。近年研究表明，自噬是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的一條重要途徑，自噬調(diào)控機(jī)制的失活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2－3］。自噬相關(guān)基因ATG5、Beclin1是參與自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，P53是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞凋亡的重要基因。已有研究顯示ATG5除參與自噬過程外，在促凋亡進(jìn)程中也起到重要作用［4］。而目前關(guān)于ATG5在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其與P53表達(dá)相關(guān)性研究較少，因此本研究采用免疫組化SP法及RTPCR檢測ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織的表達(dá)，探討ATG5、Beclin1在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與P53的關(guān)系，旨在為卵巢癌的治療尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 收集鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院和第一附屬醫(yī)院2013年9月至2015年6月的84例標(biāo)本，其中上皮性卵巢癌標(biāo)本34例，良性卵巢組織及正常卵巢組織各25例，正常卵巢組織來源于因子宮肌瘤、子宮腺肌癥等行子宮及單/雙附件切除者的卵巢。惡性卵巢組織中漿液性癌20例;黏液性癌7例;其他類型7例;按國際婦產(chǎn)科(FIGO 2000)臨床分期及病理分級標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期9例，Ⅳ期11例;G19例，G211例，G314例。標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，均未接受術(shù)前放療、化療。

1.2 主要試劑 免疫組化主要試劑:ATG5、Beclin1及P53多克隆抗體(武漢三鷹生物科技公司);兩步法兔/鼠通用免疫組化試劑盒(武漢三鷹生物科技公司)RTPCR主要試劑:RNA提取試劑盒(康為世紀(jì))、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)，引物合成(金瑞斯生物科技)。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化染色檢測 采用免疫組化SP法，按照試劑盒方法進(jìn)行操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，置于枸櫞酸緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，然后逐步滴加過氧化物酶阻斷劑(37°避光20 min)，血清封閉(1%脫脂奶粉避光30 min)，一抗(4°孵育過夜)，二抗(37°孵育30 min)，DAB染色，蘇木紫復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

判斷標(biāo)準(zhǔn):陽性結(jié)果判定:胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。依照切片中細(xì)胞的染色強(qiáng)度(抗原含量)和陽性細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行分析。每張切片至少觀察5～10個高倍鏡視野。細(xì)胞陽性著色程度:背景清晰無色為0分，輕度著色為1分;中度著色為2分;重度著色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)量:①1分:陽性細(xì)胞數(shù)＜25%;②2分:陽性細(xì)胞數(shù)25%～75%;③3分:陽性細(xì)胞數(shù)＞75%。①+②為0～2分，計(jì)作免疫組織染色陰性，3～6分計(jì)作免疫組織染色陽性。

1.3.2 RT－PCR方法 ①組織RNA的提取:將組織在液氮中磨碎，每50～100 mg組織加入1 ml RNA提取液，溶液裂解后經(jīng)氯仿等提取細(xì)胞總RNA以DNA/RNA測定儀測定RNA的純度和濃度，調(diào)整mRNA濃度在1.8～2.0。②cDNA的合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。③引物設(shè)計(jì)見表1，以NADPH作為內(nèi)參照，反應(yīng)體系為:2×PCRMaster－Mix 10μl，上、下游引物各0.6μl，cDNA模板10μl，去離子水8.4μl，總體積為20μl。PCR條件為:95℃1 min，95℃15 s，60℃45 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置無cDNA模板的空白對照。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(即CT值)。用2－△△CT表示mRNA的相對表達(dá)量(△CT=CT目的基因－CT內(nèi)參，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組－△CT對照組)。

表1 ATG5、Beclin1及P53的引物設(shè)計(jì)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，RT－PCR數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，陽性率比較采用Fisher確切概率法，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化

2.1.1 ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織中的表達(dá) ATG5、Beclin1的表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，P53主要表達(dá)在胞核內(nèi)，見圖1。ATG5、Beclin1在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織中的表達(dá)陽性率，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。P53在卵巢癌組織中的表達(dá)陽性率與良性卵巢組織、正常卵巢組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而良性卵巢組織與正常卵巢組織表達(dá)陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

2.1.2 卵巢癌組織中ATG5、Beclin1和P53的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 不同臨床分期、病理分期的卵巢癌組織中的ATG5、Beclin1及P53的表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而不同年齡、病理類型及淋巴轉(zhuǎn)移的ATG5、Beclin1及P53的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

2.1.3 上皮性卵巢癌組織中ATG5、Beclin1及P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，上皮性卵巢癌組織中ATG5與Beclin1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)、ATG5與P53、Beclin1與P53蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。見表4、表5。

表2 ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織中的表達(dá)陽性率(n，%)

表3 卵巢癌組織中ATG5、Beclin1和P53的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n，%)

表4 上皮性卵巢癌組織中P53與ATG5、Beclin1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表5 上皮性卵巢癌組織中ATG5與Beclin1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.2 RT－PCR 上皮性卵巢癌組織中ATG5、Beclin1的表達(dá)低于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織，良性卵巢組織低于正常卵巢組織(P＜0.05)。上皮性卵巢癌組織中P53的表達(dá)高于良性卵巢組織及正常組織(P＜0.05)，但良性卵巢組織與正常卵巢組織相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表6。

3 討論

在真核細(xì)胞中，自噬是細(xì)胞通過降解自身胞質(zhì)中的部分蛋白和部分細(xì)胞器以度過饑餓，并清除氧化損傷的異常大分子及細(xì)胞器，從而在應(yīng)激中維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程［5］。目前關(guān)于腫瘤細(xì)胞自噬的研究報道不一，有研究表明腫瘤細(xì)胞的自噬活性降低，也有研究顯示某些腫瘤細(xì)胞保持了較高的自噬活性，如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌等［6－7］。

表6 ATG5、Beclin1與P53在不同卵巢組織中mRNA的相對表達(dá)量(±s)

表6 ATG5、Beclin1與P53在不同卵巢組織中mRNA的相對表達(dá)量(±s)

類別 n ATG5 Beclin1 P53卵巢癌組織25 0.256±0.076 0.234±0.047 0.843±0.134良性卵巢組織 25 0.514±0.016 0.536±0.066 0.252±0.113正常卵巢組織34 0.613±0.057 0.624±0.027 0.236±0.089

圖1 ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織中的蛋白表達(dá)情況(×400)

ATG5是調(diào)控自噬的重要基因，在自噬體膜的延伸階段需要2個類泛素蛋白質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo):ATG5－Atg12結(jié)合系統(tǒng)和ATG8－PE結(jié)合系統(tǒng)。ATG5與Atg12形成的復(fù)合物定位于自噬體的表面，促進(jìn)自噬體膜的延伸擴(kuò)張，誘導(dǎo)自噬體的形成，是自噬體形成的必要因素［8］。Beclin1是第一個發(fā)現(xiàn)的哺乳動物自噬基因。研究表明，Beclin1主要對自噬體的形成和成熟進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖功能［9］。P53在自噬中也發(fā)揮著重要的作用，在細(xì)胞核中P53可通過激活mTOR上游一些調(diào)節(jié)因子而上調(diào)細(xì)胞自噬，這些因子主要包括PTEN、AMPK、TSC2、sestrin1和sestrin2等;而在細(xì)胞質(zhì)中，P53對細(xì)胞自噬具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。雖調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，但P53突變可使P53介導(dǎo)自噬發(fā)生改變導(dǎo)致腫瘤發(fā)展［10］。

本研究顯示，在卵巢癌組織中ATG5、Beclin1呈低表達(dá)，P53呈高表達(dá)，且隨病理分期的改變而不同。ATG5與Beclin1呈正相關(guān)，二者與P53呈負(fù)相關(guān)。在正常情況下，機(jī)體通過細(xì)胞自噬清除衰老的細(xì)胞器，維持自我更新。當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖活躍時，引起P53的活性改變，P53促使自噬相關(guān)基因ATG、Beclin1表達(dá)降低，從而降低腫瘤本身的自噬活性。由于腫瘤細(xì)胞凋亡不足、自噬功能下降，導(dǎo)致本應(yīng)該通過凋亡或自噬性死亡的細(xì)胞不能發(fā)生凋亡或自噬性死亡，引起細(xì)胞異常增多，最終導(dǎo)致癌變。

綜上所述，卵巢癌自噬相關(guān)基因ATG5、Beclin1與凋亡相關(guān)基因P53在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)調(diào)作用，對其進(jìn)行聯(lián)合檢測，有助于了解和判斷卵巢癌的進(jìn)展程度及患者的預(yù)后情況，為尋找治療卵巢癌提供新的治療靶點(diǎn)。

［1］姚俊閣，李紅雨，趙書君，等.卵巢上皮性癌組織中SOX2和CyclinD1的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2014，49(3):247－250.

［2］Helgason G V，Holyoake T L，Ryan K M.Role of autophagy in cancer prevention，development and therphy［J］.Essays Biochem，2013，55(1):133－151.

［3］Leone R D，Amaravadi R K.Autophagy targetable linchpin of cancer cell metabolism［J］.Trends Endocrinol Metab，2013，24(4):209－217.

［4］Yousefi S，Simon H U.Apoptosis regulation by autophagy gene5［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2007，63(3):241－244.

［5］Coto－Montes A，Boga J A，Rosales－Corral S，et al.Role of melatonin in the regulation of autophagy and mitophagy:are－view［J］.Mol Cell Endocrinol，2012，361(1/2):12－23.

［6］Leone R D，Amaravadi R K.Autophagy:a targetable linchpin of can－cer cell metabolism［J］.Trends Endocrinol Metab，2013，24(4):209－217.

［7］Pandey S，Chandravati.Autophagy in cervical cancer:an emerging therapeutic target［J］.Asian Pac JCancer Prev，2012，13(10):4867－4871.

［8］Kaiser S E，Mao K，Taherbhoy A M，et a1.Noncanonical E2 recruitment by the autophagy E1 revealed by Atg7－Atg3 and Atg7－Atg10 structures［J］.Nat Struct Mol Biol，2012，19(12):1242－1249.

［9］許傳杰，趙廣通，孔德娟，等.電離輻射對卵巢癌細(xì)胞SKOV3中Beclin1基因的影響［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防治雜志，2011，31(5):551－554.

［10］韋艷，吳冰.細(xì)胞自噬與腫瘤［J］.海南醫(yī)學(xué)，2014，(16):2413－2415.