羅毅，劉路培，于路

MACC1基因下調(diào)對(duì)胃腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

羅毅，劉路培，于路

目的研究下調(diào)MACC1表達(dá)對(duì)胃腺癌細(xì)胞株MGC-803生長(zhǎng)作用的影響。方法設(shè)計(jì)并合成RNAi干擾片段，脂質(zhì)體介導(dǎo)MACC1-siRNA1（MACC1-siRNA1組）和MACC1-siRNA2（MACC1-siRNA2組）轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞，同時(shí)設(shè)非特異性干擾片段為對(duì)照組。應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組MACC1的mRNA表達(dá)，噻唑藍(lán)比色實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNAi轉(zhuǎn)染后MGC-803細(xì)胞增殖能力的變化，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MACC1、P21、CDK4、CCND1和c-myc蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果與對(duì)照組相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組MACC1表達(dá)在mRNA及蛋白水平下降，細(xì)胞的增殖速度變慢，單克隆形成數(shù)量減少，細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例顯著升高，P21的表達(dá)增加，MACC1、CDK4、CCND1和c-myc的表達(dá)減少。結(jié)論下調(diào)MACC1能使MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制細(xì)胞的增殖，MACC1可以作為治療胃癌的有效靶點(diǎn)。

胃腫瘤；腺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；RNA干擾；MACC1基因；MGC-803細(xì)胞

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，外科手術(shù)是其主要的治療手段，術(shù)后輔以藥物化療或放療等。雖然經(jīng)過正規(guī)和系統(tǒng)治療，但效果并不滿意，僅有30%～50%的患者得到根治性切除，大多數(shù)患者死于局部進(jìn)展、早期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)［1］。MACC1是近年來研究較多的一個(gè)基因，有研究顯示MACC1在胃癌中過表達(dá)，并且與胃癌的病理分期和預(yù)后具有密切的聯(lián)系，可作為預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的指標(biāo)［2-3］。雖然目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量的關(guān)于MACC1基因與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究，但是與胃癌生長(zhǎng)調(diào)控作用方面的研究甚少。本研究旨在觀察MACC1對(duì)MGC-803細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控作用，探究其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料MGC-803細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；二甲基四氮唑藍(lán)（MTT）、碘化丙啶（PI）和二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；Lipofectamine2000、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PMSF及RIPA蛋白裂解液為碧云天公司產(chǎn)品；MACC1、P21、CDK4、CCND1和c-myc單克隆抗體購(gòu)自Epitomics公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自美國(guó)Milli?pore公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（ECL）、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；Mx3000PTM Real Time PCR儀為Stratagene公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)及合成針對(duì)MACC1基因的siRNA干擾片段。MACC1-siRNA1組：5′-GCCACACATGCTTAAC?CATGA-3′；MACC1-siRNA2組：5′-GGAAGCAGGTGAAG?TAGTTCA-3′。轉(zhuǎn)染前24 h接種MGC-803細(xì)胞于直徑60 mm皿中，在細(xì)胞密度達(dá)50%～70%匯合度時(shí)，將培基換成無血清培基。將稀釋好的干擾片段與LipofectamineTM2000脂質(zhì)體輕柔混勻，室溫孵育20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6～8 h后更換完全培養(yǎng)基。48 h后檢測(cè)干擾效率。以非特異性干擾片段（Negative control，5′-GCCAGCT?TAGCACTGACTC-3′，不針對(duì)任何已知人mRNA）為對(duì)照組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)干擾效率轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取RNA，檢測(cè)RNA濃度和純度后，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，然后按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)，以βactin為內(nèi)參。MACC1引物：上游5′-GGCTGTGATGCTAC?GAGATA-3′，下游5′-ACACCAGGACAATGCCTACT-3′；βactin引物上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA-3′。總反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s；94℃10 s，55℃10 s，72℃8 s，40個(gè)循環(huán)；95℃1 min，55℃30 s，95℃30 s，繪制熔解曲線。各組均設(shè)復(fù)孔3個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果判定采用2-ΔΔCT法：△CT= CT目的基因-CT內(nèi)參，△△CT=△CT處理組-△CT對(duì)照組，處理組的相對(duì)表達(dá)值=2-△△CT，對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量=1。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取MACC1-siRNA1，MACC1-siRNA2和對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，將細(xì)胞消化下來，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200 μL，每組5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（僅加培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)1、2、3、4和5 d，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，室溫孵育10 min，微振蕩器振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白對(duì)照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀上490 nm測(cè)定各孔光密度（OD）值，以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。各組取5個(gè)孔平均值，重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)取MACC1-siRNA1，MACC1-siRNA2和對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞板計(jì)數(shù)，接種200個(gè)細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板中，每種細(xì)胞接種2孔，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞分散均勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆，甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥；用Giemsa應(yīng)用染液染色5 min，流水緩慢洗去染液，空氣干燥后顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期收取MACC1-siRNA1、MACC1-siRNA2和對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，各組細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/mL，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇混勻，4℃固定過夜，用冷PBS離心洗滌1次，加入400 μL PBS，RNase A至終濃度0.5 g/L，碘化丙啶（PI，10 mg/L）染色20～30 min；避光放置15 min，上機(jī)檢測(cè)。全部數(shù)據(jù)經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CELLQuest軟件獲取。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染72 h后收集MACC1-siRNA1、MACC1-siRNA2和對(duì)照組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取待測(cè)細(xì)胞的總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，配制10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，每孔加入等量待測(cè)蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠恒壓80 V 30 min，分離膠恒壓100 V 90 min。采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，根據(jù)蛋白Marker所指示的條帶位置，將目的蛋白所在范圍的膜裁剪下來，同時(shí)裁剪β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照。含5%BSA的TBST封閉液室溫孵育1 h。用封閉液稀釋一抗，MACC1、P21、CDK4、CCND1和c-myc兔抗人單克隆抗體（1∶500稀釋）和β-actin鼠抗人單克隆抗體（1∶1 000稀釋），室溫孵育2 h，4℃孵育過夜。次日取出膜，室溫下TBST洗膜；用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗（1∶1 000稀釋），室溫孵育1 h，TBST洗膜。按照ECL檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果對(duì)照組、MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組細(xì)胞MACC1相對(duì)表達(dá)量分別為1.003±0.085、0.117±0.012和0.098±0.008，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=116.02，P＜0.001）。

2.2 MTT結(jié)果與對(duì)照組細(xì)胞相比，沉默MACC1后的MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組細(xì)胞增殖速度明顯減慢，見圖1。

Fig.1Cell growth curves of all three groups圖1 各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.3 平板克隆結(jié)果各組細(xì)胞均能形成克隆菌落，對(duì)照組、MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組克隆數(shù)分別為106.64±12.22、48.50±10.13和32.62± 6.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.57，P＜0.01），與對(duì)照組相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組形成的克隆數(shù)明顯減少（均P＜0.05），見圖2。

Fig.2Colony formation ability of all three groups圖2 各組細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

Fig.3Cell cycles of negative control，MACC1-siRNA1 and MACC1-siRNA2 detected by flow cytometry圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞周期分布

2.4 細(xì)胞周期結(jié)果與對(duì)照組處于G1期細(xì)胞百分率（45.36±1.21）%相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組的G1期細(xì)胞百分率分別為（60.34±1.81）%和（61.25±1.36）%，G1期百分率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=108.70，P＜0.001），見圖3。

2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量結(jié)果與對(duì)照組相比，MACC1-siRNA1組和MACC1-siRNA2組MGC-803細(xì)胞中MACC1、CDK4、CCND1和c-myc表達(dá)量減少，P21表達(dá)量增加，見圖4。

Fig.4Protein expression of MACC1，CDK4，CCND1，c-myc and P21 after MACC1 silencing detected by Western blot analysis圖4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MACC1、CDK4、CCND1、c-myc和P21的表達(dá)

3 討論

MACC1是由Stein等［4-5］通過差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在結(jié)腸癌中獲得的調(diào)控結(jié)腸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的新基因，定位于人類7號(hào)染色體（7p21.1），含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，其cDNA含2 559個(gè)核苷酸序列，編碼由852個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，MACC1明顯增加了腸癌細(xì)胞的增殖、侵犯及擴(kuò)散，在小鼠模型中，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力亦明顯增強(qiáng)。在肺癌［6］、肝癌［7］、胰腺癌［8］、卵巢癌［9］、乳腺癌［10］等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)，MACC1可影響癌癥患者的預(yù)后或術(shù)后復(fù)發(fā)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。Zhang等［11］發(fā)現(xiàn)，MACC1在卵巢癌組織中高表達(dá)，MACC1基因沉默后，卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力明顯降低；尚超等［12］通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)腎癌組織發(fā)現(xiàn)已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者癌組織中MACC1的表達(dá)量為未轉(zhuǎn)移癌組織中的2.45倍，抑制腎癌細(xì)胞Caki-1的MACC1的表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力明顯下降；Muendlein等［13］另外研究發(fā)現(xiàn)MACC1的表達(dá)與原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示MACC1可作為乳腺癌患者生存預(yù)后的指標(biāo)，其表達(dá)狀態(tài)可用來評(píng)估新型抗乳腺癌治療的有效性。Wang等［14-15］采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)97例胃癌組織及癌旁正常組織中MACC1蛋白的表達(dá)，并分析其與臨床病理資料的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MACC1蛋白的異常高表達(dá)與分化程度、腹膜轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，MACC1可以作為預(yù)測(cè)腹膜轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移，評(píng)價(jià)胃癌進(jìn)展的有效指標(biāo)，為胃癌患者的臨床診療提供依據(jù)。隨后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MACC1是胃癌的癌基因，可影響胃癌的術(shù)后復(fù)發(fā)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移，并可能是通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的途徑而影響胃癌的惡性生物學(xué)行為。然而關(guān)于MACC1在胃癌生長(zhǎng)調(diào)控的作用及其機(jī)制尚少見報(bào)道。本研究運(yùn)用RNAi沉默MGC-803細(xì)胞中MACC1基因表達(dá)，通過噻唑藍(lán)比色（MTT）實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)MACC1基因的表達(dá)后，MGC-803細(xì)胞的體外增殖能力明顯變慢，同時(shí)MGC-803細(xì)胞中與細(xì)胞周期相關(guān)因子CDK4、CCND1和c-myc表達(dá)量減少，P21的表達(dá)量增加，提示沉默MACC1基因的表達(dá)能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力，且對(duì)細(xì)胞增殖能力的抑制主要是通過其對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，MACC1作為一種新發(fā)現(xiàn)的癌基因，不僅可影響EMT的發(fā)生，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而且通過對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控，影響細(xì)胞的分裂增殖過程，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力。MACC1可以作為治療胃癌的有效靶點(diǎn)，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（2014-06-18收稿2014-12-04修回）

（本文編輯魏杰）

Effect of MACC1 down-regulation on proliferation of gastric adenocarcinoma cell line

LUO Yi，LIU Lupei，YU Lu
Department of Emergency，Liuzhou People′s Hospital Affiliated to Guangxi University of Technology，Guangxi 545006，China

ObjectiveTo study the effects of MACC1 down-regulation on the growth of gastric adenocarcinoma cells.MethodssiRNA（MACC1-siRNA1 and MACC1-siRNA2）that can transiently silenced MACC1 was designed，syn?thesized and transfected into MGC-803 cells by lipofectamine 2000.Non-specific siRNA was transfected to be used as nega?tive control.The efficiency of MACC1 depletion was determined by Real-time quantitative PCR.MTT，colony formation and flow cytometry assay were performed to examine cell proliferation.The expressions of MACC1，P21，CDK4，CCND1 and cmyc were determined by Western blot.ResultsCompared with cells in negative control group，transiently silencing MACC1 decreased the expression of MACC1 in MGC-803 cells shown by Real-time PCR.MACC1 downregulation drastical?ly changed the proliferation，colony formation and cell cycle of gastric adenocarcinoma cells in vitro（P＜0.05）.The expres?sions of MACC1，CDK4，CCND1 and c-myc proteins in cells of MACC1 silence group were much lower while P21 expres?sion level was much higher than those in negative control.ConclusionDown-regulation of MACC1 result in blocking cell cycle，inhibiting proliferation of MGC-803 cells.So it may serve as a promising target in the treatment of gastric cancer.

stomach neoplasms；adenocarcinoma；cell proliferation；cell cycle；RNA interference；MACC1；MGC-803 cell

R735.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.007

廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院急癥科（郵編545006）

羅毅（1978），男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事胃腸道腫瘤發(fā)病機(jī)制研究