楊 超 丁永學(xué) 孔垂?jié)?刻校吾 張閣均

1.遼陽(yáng)市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧遼陽(yáng) 111000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110000

糖尿病大鼠陰莖組織中糖基化終產(chǎn)物、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)分析

楊 超1丁永學(xué)1孔垂?jié)?刻校吾2張閣均2

1.遼陽(yáng)市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧遼陽(yáng) 111000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110000

目的探討糖尿病大鼠陰莖組織糖基化終產(chǎn)物（AGEs）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)變化及它們表達(dá)的相關(guān)性。 方法64只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組（DM組）和對(duì)照組（NC組），各32只。在DM組大鼠模型制備成功后的4、8、12、20周，兩組各殺檢8只大鼠。使用免疫組織化學(xué)法觀察陰莖組織中AGEs、iNOS的表達(dá)定位同時(shí)分析其含量變化，使用Real-time PCR檢測(cè)陰莖組織中AGEs、iNOSmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果大量AGEs和iNOS陽(yáng)性細(xì)胞分別出現(xiàn)于4、8、12、20周DM模型大鼠陰莖組織內(nèi)，其累計(jì)光密度（IOD）值高于對(duì)照組，并隨病程進(jìn)展而增高（P＜0.05，P＜0.01）。Real-time PCR結(jié)果顯示，NC組大鼠在造模后4、8、12、20周AGEs和iNOS的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DM模型大鼠陰莖組織AGEs和iNOSmRNA表達(dá)水平隨著病程進(jìn)展逐漸增加（P＜0.01），且高于相同時(shí)間點(diǎn)的NC組（P＜0.01），Pearson相關(guān)分析顯示，DM大鼠陰莖組織AGEs與iNOS的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=0.845，P＜0.01）。 結(jié)論高血糖狀態(tài)下，陰莖組織內(nèi)AGEs和iNOS的表達(dá)顯著增加并呈正相關(guān)，可能共同參與了DM陰莖損害的發(fā)生。

糖尿?。魂幥o組織；糖基化終產(chǎn)物；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；大鼠

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種由于胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺乏引起糖代謝異常的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致患者出現(xiàn)心腦血管、腎、眼底等多器官的并發(fā)癥，其中勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一，有報(bào)道糖尿病性ED發(fā)病率高達(dá)75%，較非糖尿病患者高3倍，并隨年齡的增長(zhǎng)和病程的延長(zhǎng)而明顯增加；10年以內(nèi)病史者，50%以上合并ED，且糖尿病性ED（DMED）患者比普通ED患者癥狀更為嚴(yán)重［1］。DMED的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法和Real-time PCR動(dòng)態(tài)觀察DM大鼠陰莖組織糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的變化及兩者的關(guān)系，初步探討DMED的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與取材

將64只SPF級(jí)Wistar大鼠［雄性，2月齡，體質(zhì)量為（200±20）g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供］隨機(jī)分入糖尿?。―M）組和正常對(duì)照（NC）組，每組各32只。禁食12 h后，以65 mg/kg的劑量向DM組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，購(gòu)自Sigma公司）溶液，NG組注射同體積的枸櫞酸緩沖液。72 h后測(cè)尾靜脈血葡萄糖濃度＞16.7 mmol/L（羅氏診斷公司產(chǎn)品），并持續(xù)1周為模型成功。分別在實(shí)驗(yàn)第4、8、16、20周末脫頸椎處死兩組大鼠各8只，消毒后切取陰莖組織，仔細(xì)分離表皮，剪除陰莖頭和陰莖腳部，留取海綿體組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制備蠟塊。并同時(shí)留取各組大鼠的新鮮陰莖組織，置于TRIzol中，留作提取RNA。

1.2 免疫組織化學(xué)法

將制備的組織蠟塊使用切片機(jī)切片，厚度5μm，于42℃水浴展片，貼于載玻片上，65℃烤片2 h后，經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，100%乙醇Ⅰ5min，100%乙醇Ⅱ5 min，90%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5min，梯度透明，然后枸櫞酸鈉緩沖液（10mmol，pH 6.0）中高壓鍋內(nèi)煮沸，上氣3 min后緩慢冷卻進(jìn)行抗原修復(fù)，然后使用SP免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物有限公司）進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)所用抗體為兔抗大鼠多克隆AGEs抗體（天津醫(yī)大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）和兔抗大鼠iNOS型多克隆抗體（武漢博士德生物制品司），使用濃度分別為1∶500和1∶75稀釋。結(jié)果判定：光鏡下見(jiàn)組織切片細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。圖像分析：Meta Morph高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)（美國(guó)UIC公司）對(duì)免疫組織化學(xué)切片隨機(jī)選取高倍視野，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400），對(duì)圖片陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行累計(jì)光密度值IOD量化測(cè)定。

1.3 Real-time PCR

取兩組大鼠的陰莖組織，根據(jù)Trizol法提取大鼠陰莖組織的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，用AGEs和iNOS的特異性引物檢測(cè)AGEs和iNOS的表達(dá)，引物序列（上海生工）如下：AGEs：sense5'-TCCCCCACAGTGTTTCACAGT-3'，anti-sense 5'-GTGGACCCAGCAGG CTATGT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為100 bp，iNOS：sense 5'-CA CGACCCAGACTTCAGAGTA-3'，anti-sense 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為339 bp，GAPDH：sense5'-AGAGGAGAGGAAGGCCCCAGA-3'，anti-sense 5'-GGCAAGGTGGGGTTATACAGG-3'擴(kuò)增片段為239 bp，循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性2 min；94℃15 s，64℃40 s，40次循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AGEs在DM模型大鼠陰莖組織中的表達(dá)

NC組大鼠在造模后4、8、12、20周，AGEs的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），DM模型大鼠陰莖海綿體組織于第4周可見(jiàn)大量的AGEs陽(yáng)性細(xì)胞，隨著病程進(jìn)展，8、12、20周DM模型大鼠AGEs的表達(dá)量逐漸增加（P＜0.01），且4、8、12、20周各時(shí)間點(diǎn)DM組大鼠的AGEs陽(yáng)性細(xì)胞累計(jì)光密度值明顯高于NC組（P＜0.01）（圖1、表1）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)兩組大鼠陰莖海綿體組織AGEs的表達(dá)情況

表1 兩組大鼠陰莖海綿體組織AGEs累計(jì)光密度值的比較（±s）

表1 兩組大鼠陰莖海綿體組織AGEs累計(jì)光密度值的比較（±s）

與NC組同時(shí)間比較，*P＜0.01；4、8、12、20周DM組內(nèi)比較，#P＜0.01

組別 n 4周 8周 12周 20周NC組DM組88 2.159±0.186 2.718±0.290*#2.198±0.248 3.623±0.333*#2.292±0.316 4.210±0.402*#2.382±0.338 4.899±0.555*#

2.2 AGEsmRNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，NC組大鼠在造模后4、8、12、20周AGEsmRNA的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），DM模型大鼠AGEsmRNA的表達(dá)逐漸增加（P＜0.01），且明顯高于NC組（P＜0.01）（圖2）。

圖2 AGEsm RNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達(dá)

2.3 iNOS在DM模型大鼠陰莖組織中的表達(dá)

NC組大鼠在造模后4、8、12、20周iNOS的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），DM模型大鼠陰莖海綿體組織于第4周可見(jiàn)大量的iNOS陽(yáng)性細(xì)胞，隨著病程進(jìn)展，8、12、20周DM模型大鼠iNOS的表達(dá)量逐漸增加（P＜0.01），且4、8、12、20周各時(shí)間點(diǎn)，DM組大鼠的iNOS陽(yáng)性細(xì)胞累計(jì)光密度值高于NC組 （P＜0.05，P＜0.01）（圖3、表2）。

圖3 免疫組化檢測(cè)兩組大鼠陰莖海綿體組織iNOS的表達(dá)情況

表2 兩組大鼠陰莖海綿體組織iNOS累計(jì)光密度值的比較±s）

表2 兩組大鼠陰莖海綿體組織iNOS累計(jì)光密度值的比較±s）

與NC組同時(shí)間比較，*P＜0.05，#P＜0.01；4、8、12、20周DM組內(nèi)比較，▲P＜0.01

組別 n 4周 8周 12周 20周NC組DM組88 1.805±0.382 2.162±0.180*▲2.029±0.267 2.731±0.361#▲2.248±0.262 3.292±0.404#▲2.364±0.241 4.266±0.447#▲

2.4 iNOSmRNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，NC組大鼠在造模后4、8、12、20周iNOSmRNA的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DM模型大鼠iNOSmRNA的表達(dá)逐漸增加（P＜0.01），且明顯高于NC組（P＜0.01）（圖4）。

圖4 iNOSm RNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達(dá)

2.5 AGEs、iNOS的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DM大鼠陰莖海綿體組織中AGEs、iNOS陽(yáng)性細(xì)胞均隨著病程的延長(zhǎng)逐漸增加，兩者累計(jì)光密度值之間呈顯著正相關(guān)（r=0.845，P＜0.01）（圖5）。

圖5 AGEs、iNOS的相關(guān)性分析

3 討論

陰莖解剖結(jié)構(gòu)完整及海綿體平滑肌舒張是陰莖勃起的關(guān)鍵。DMED的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，大多研究認(rèn)為與DM所致的血管、神經(jīng)及海綿體血竇內(nèi)皮等功能受損，影響陰莖海綿體平滑肌的舒張有關(guān)，導(dǎo)致陰莖ED［2-4］。近年來(lái)，一些研究顯示，一氧化氮-環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（NO-cGMP）、AGEs［5］等因素也在DMED的發(fā)生中具有重要作用。本研究通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察DM模型大鼠陰莖海綿體AGEs和iNOS的表達(dá)變化探討兩者在DMED發(fā)生過(guò)程中的機(jī)制。

AGEs是一種異質(zhì)性的復(fù)合物，DM時(shí)持續(xù)高血糖可導(dǎo)致體內(nèi)各種組織蛋白的非酶糖基化水平異常增高，使AGEs產(chǎn)量增高。Seftel等［6］發(fā)現(xiàn)，DM患者陰莖組織中AGEs含量較正常人高，而且主要沉積在DM患者陰莖海綿體組織和陰莖白膜膠原組織；大量實(shí)驗(yàn)表明，AGEs通過(guò)氧化應(yīng)激引起陰莖血管、神經(jīng)病變以及NO等多種勃起神經(jīng)遞質(zhì)的改變，促進(jìn)DMED的發(fā)生、發(fā)展［7］，這可能與AGEs和細(xì)胞膜表面受體RAGE相結(jié)合產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激活性氧簇ROS的生成有關(guān)。同時(shí)有研究顯示，給予AGE抑制劑或抗氧化治療可以改善DM大鼠的ED［8-10］。本研究中對(duì)造模后4、8、12、20周的大鼠陰莖組織AGEs蛋白及mRNA的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，結(jié)果顯示，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，AGES蛋白及mRNA的表達(dá)水平逐漸增高，而且高于NC大鼠，進(jìn)一步說(shuō)明AGEs在DMED的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用，與前面的結(jié)果相一致。

L-Arg-NO-cGMP通路是陰莖勃起的重要機(jī)制，其中NO的產(chǎn)生是平滑肌舒張的關(guān)鍵影響因素。NOS是合成NO的關(guān)鍵酶，包括nNOS、eNOS和iNOS，其中nNOS和eNOS都在海綿體平滑肌舒張陰莖勃起中具有重要作用［11-12］，iNOS在正常、年輕的陰莖內(nèi)僅有少量表達(dá)，主要在病理情況下表達(dá)升高，在正常生理情況下對(duì)NO的生成發(fā)揮作用較少［13］。Podlasek等［14］的研究表明，DM大鼠陰莖組織中nNOS和eNOS表達(dá)較正常大鼠低，而iNOS表達(dá)則高于正常大鼠。本研究結(jié)果顯示，造模后4、8、12、20周的大鼠陰莖組織iNOS蛋白及mRNA的表達(dá)水平隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，而且AGEs的表達(dá)水平與iNOS呈正相關(guān)，提示可能AGEs和iNOS通過(guò)某種聯(lián)系在DMED過(guò)程中發(fā)揮作用。

有報(bào)道顯示，一定環(huán)境中AGEs能促進(jìn)iNOS表達(dá)［15］；Chang等［16］發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞中AGEs通過(guò)p38MAPK依賴(lài)信號(hào)通路增強(qiáng)iNOs活性，催化生成過(guò)量的NO；Wang等［17］發(fā)現(xiàn)，AGEs誘導(dǎo)iNOS在鼠類(lèi)小膠質(zhì)細(xì)胞岬N-11中表達(dá)，促進(jìn)了阿爾海默病的發(fā)生，因此本研究可能提示在DMED的發(fā)生過(guò)程中可能是長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)下AGEs表達(dá)增加，并誘導(dǎo)陰莖海綿體組織中iNOS的表達(dá)，造成過(guò)量的NO在組織中積聚。DM氧化應(yīng)激狀態(tài)下生成的大量ROS可與NO生成過(guò)氧化亞硝酸鹽陰離子（ONOO-），消耗大量NO，降低了NO相對(duì)有效濃度［18-20］，從而影響了陰莖海綿體平滑肌的舒張功能，導(dǎo)致了DMED，而且AGEs 與iNOS的相互作用過(guò)程中產(chǎn)生大量的ROS、NO、ONOO-，可有細(xì)胞毒作用，通過(guò)多種途徑介導(dǎo)陰莖組織細(xì)胞（平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）凋亡，影響陰莖的勃起功能。

綜上所述，AGEs與iNOS的內(nèi)在聯(lián)系可能從一個(gè)全新的角度闡述DMED的發(fā)病機(jī)制，即高糖環(huán)境誘導(dǎo)陰莖組織AGEs表達(dá)增高，AGEs增加陰莖海綿體組織iNOS的量與活性，通過(guò)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、降低NO利用率等途徑參與DMED的發(fā)生、發(fā)展，但是這種機(jī)制具體的發(fā)生過(guò)程還需要進(jìn)一步通過(guò)加大樣本量和相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)進(jìn)行確認(rèn)。

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The exPression analysis of AGEs and iNOS in Penile tissue of rats with diabetes mellitus

YANG Chao1DING Yong-xue1KONG Chui-ze2LIU Xiao-wu2ZHANG Ge-jun2
1.Department of Urology，Liaoyang Central Hospital in Liaoning Province，Liao yang 111000，China；2.Department of Urology，the First Hospital Affiliated to China Medical University，Shenyang 110000，China

Objective To study the change of the expressions of advanced glycation end products（AGEs）and inducible nitric oxide synthase （iNOS）in penile tissue of rats with diabetes mellitus and the relationship of the expressions of AGEs and iNOS.Methods 64maleWistar ratswere distributed randomly into the diabeticmodel group（the DM group）and the control group （the NC group），and therewere 32rats in each group.After 4，8，12 and 20 weeks DM models being successfully prepared，8 rats in both groupswere killed.Change of the expression and localization of AGEs and iNOS in penile tissuewere observed and its change of contentwas analyzed by immunohistochemicalmethod，and the expression of AGEs and iNOSmRNA in penile tissue was detected by Real-time PCR.Results A large number of AGEs and iNOSpositive cells appeared in the penile tissue of themodel ratswith diabetes mellitus at 4，8，12 and 20 weeks respectively，the integrated option density （IOD）of these cellswere higher than those of the cells in the control group and the IOD value gradually degraded with the progression of disease （P＜0.05，P＜0.01）.Real-time PCR results show that after 4，8，12 and 20 weeksmodeling，there was no statistical difference of the AGEs and iNOSexpression of rats in NC group （P＞0.05），and the AGEs and iNOSmRNA expression level increased in penile tissue of DM model rats（P＜0.01），and its expression level was higher than the same time point of the NC group （P＜0.01）.Pearson correlation analysis showed there was a positive relationship of the expression level of AGEswith that of iNOS （r=0.845，P＜0.01）.Conclusion The expressions of AGEs and iNOS of penile tissue are markedly increased and closely correlated with each other in the status of high blood sugar and theymight collectively participate in the occurrence of penis injury in diabetes mellitus.

Diabetes mellitus；Penile tissue；Advanced glycation end products；Inducible nitric oxide synthase；Rat

R332

A

1674-4721（2015）02（c）-0008-05

2015-01-15本文編輯：許俊琴）