董曉東++++楊素英++++丁楠++++俞艷彬

摘要：動(dòng)物纖維的鑒別屬于紡織品檢測(cè)行業(yè)的難題之一，DNA分析技術(shù)因其客觀準(zhǔn)確性而給動(dòng)物纖維檢測(cè)客觀法帶來了曙光。本文主要綜述了DNA分析技術(shù)鑒別動(dòng)物纖維的研究現(xiàn)狀，介紹了DNA分析技術(shù)的原理，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：DNA技術(shù)；動(dòng)物纖維；PCR擴(kuò)增；PCR-RFLP技術(shù)；real-time PCR技術(shù)

1 引言

近幾年來，隨著人們生活水平的提高，天然動(dòng)物纖維及皮革制品越來越受到消費(fèi)者的青睞。目前，動(dòng)物纖維檢測(cè)方法主要包括顯微鏡法 [1]和掃描電鏡法[2]，二者均通過纖維鱗片形態(tài)特征來對(duì)纖維種類進(jìn)行鑒別。但是，動(dòng)物纖維的形態(tài)特征會(huì)因加工條件、氣候條件及膳食結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生變化[3]，這就給顯微鏡法的鑒別帶來了困難，而且顯微鏡法對(duì)試驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，主觀干擾大，所以相關(guān)行業(yè)對(duì)客觀性高的檢測(cè)方法的需求越來越大。

近年來，隨著DNA分子技術(shù)的逐步成熟，研究人員通過鑒別不同動(dòng)物的DNA序列信息，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物纖維及其混合物的定性定量，并在逐步完善此技術(shù)。DNA分子技術(shù)由于其檢測(cè)結(jié)果的客觀性而廣泛應(yīng)用于司法、醫(yī)學(xué)研究及診斷領(lǐng)域，同以上兩種方法相比，DNA法的檢測(cè)結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確。

2 DNA定性定量原理

DNA分子，即脫氧核糖核酸，是由堿基、脫氧核糖和磷酸組成的長(zhǎng)鏈多聚物。不同的生物所具備的DNA分子在長(zhǎng)短和結(jié)構(gòu)上有一定的差異，堿基的排列順序也不盡相同[4]。通過對(duì)DNA分子的核苷酸排列順序進(jìn)行測(cè)定即可實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物纖維的定性定量檢測(cè)。DNA分析檢測(cè)技術(shù)一般包括以下幾個(gè)步驟：

（1）DNA的提取。動(dòng)物毛纖維的基因組DNA主要存在于毛囊部分，而紡織類動(dòng)物纖維一般只取毛干部分，故只能提取毛干線粒體中的DNA。DNA的提取主要包括前處理、分離、純化和濃縮階段。此階段所提取的樣品將直接影響到后續(xù)的擴(kuò)增及DNA序列的測(cè)定，高質(zhì)量的DNA是實(shí)現(xiàn)DNA檢測(cè)的第一步，因此，提取的DNA樣品應(yīng)防止其他因素的干擾與污染。

（2）PCR擴(kuò)增。PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是生物體外特殊的DNA復(fù)制反應(yīng)，能將微量的DNA大幅增加。目標(biāo)DNA片段經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，在數(shù)小時(shí)內(nèi)即可擴(kuò)增放大數(shù)百萬(wàn)倍。

（3）DNA序列的測(cè)定。DNA序列測(cè)定是檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵所在。通過不同纖維所具備的特異堿基對(duì)排列即可實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維的鑒別。目前，Sanger雙脫氧末端終止法在此領(lǐng)域應(yīng)用較廣，通過電泳和放射自顯影技術(shù)對(duì)所提取的DNA片段進(jìn)行測(cè)定，即可對(duì)纖維品種進(jìn)行鑒別。

3 DNA檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物纖維鑒別中的研究進(jìn)展

隨著DNA分子技術(shù)的不斷發(fā)展，其在動(dòng)物纖維鑒別領(lǐng)域的研究越來越廣。Hamlym P.F.等人在1992年首次制作了綿羊特性DNA探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)綿羊毛、山羊絨和馬海毛的鑒別[5]。由于當(dāng)時(shí)DNA分子技術(shù)水平較低，極大地限制了DNA技術(shù)在動(dòng)物纖維鑒別上的應(yīng)用。

PCR擴(kuò)增技術(shù)成功解決了動(dòng)物纖維基因組中DNA量少、難以提取的問題。Subramanian等[6]提取纖維毛干中線粒體DNA，通過PCR擴(kuò)增線粒體DNA細(xì)胞色素b基因的保守區(qū)域，然后選擇合適的酶切位點(diǎn)分析相應(yīng)保守區(qū)的單核苷酸多態(tài)性，根據(jù)后片段長(zhǎng)度的多態(tài)性成功鑒別出了山羊絨與綿羊毛。PCR-RFLP技術(shù)（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)）是一種基于PCR擴(kuò)增的技術(shù)，是目前識(shí)別山羊絨和綿羊毛的較好方法之一。但是，PCR-PFLP分析較為復(fù)雜，一般只能用來做定性分析，不做定量檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，Kirsten等[7]實(shí)現(xiàn)了對(duì)羊毛、羊絨、駱駝毛、牦牛毛等纖維快速簡(jiǎn)便的纖維定性分析，并且比較了清洗、漂白和染色等3步處理工序?qū)NA抽提效果的影響，研究發(fā)現(xiàn)每增加一步處理工序都會(huì)明顯降低DNA的提取率，其中染色工序?qū)NA分析的破壞最為嚴(yán)重。

金美菊等[8]針對(duì)多種產(chǎn)地的羊絨和羊毛試驗(yàn)，利用山羊與綿羊質(zhì)檢特定堿基序列的差別，通過設(shè)計(jì)不同的引物成功實(shí)現(xiàn)對(duì)純羊絨、羊毛以及羊絨羊毛混合纖維定性鑒別。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于純羊絨、純羊毛纖維，采用1組引物（CYTBF/CYTBR）對(duì)特定位點(diǎn)特征堿基序列組實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維的鑒別。對(duì)于羊絨羊毛混合物，采用羊絨引物（YM1_F/C7YGR1）和羊毛引物（YM1_F/W10YGR1）對(duì)混合纖維進(jìn)行定性鑒別。通過對(duì)羊毛、羊絨引物的設(shè)計(jì)，有效地提高了檢測(cè)的靈敏度。

相比DNA直接測(cè)序法和PCR-RFLP法，Real-time PCR（實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)）具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)[9]。Real-time PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，最終通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量。費(fèi)靜等[10]設(shè)計(jì)針對(duì)兔和狐線粒體12SrRNA基因的特異性TaqMan探針和引物對(duì)，建立了兔毛纖維和狐貍毛纖維的鑒別方法，此方法特異性較好，并且靈敏度達(dá)到了1%，并且在驗(yàn)證實(shí)例中得到滿意的結(jié)果。紫山羊絨與牦牛毛在顯微鏡下外觀形態(tài)極其相似，非常難以鑒別，Lu等[11]設(shè)計(jì)針對(duì)牦牛毛和紫山羊絨12SrRNA基因的TaqMan探針和引物對(duì)，建立了牦牛毛纖維和紫山羊絨纖維的鑒別法，分別對(duì)染色和漂白樣品分別進(jìn)行鑒別，鑒別結(jié)果也十分滿意，靈敏度也達(dá)到了1%。陳國(guó)培等[12]建立羊毛羊絨熒光PCR檢測(cè)體系，并對(duì)檢測(cè)方法特異性和檢出限進(jìn)行分析，結(jié)果表明此方法特異性好，檢出限為10ngDNA，同時(shí)對(duì)16個(gè)樣品進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)，結(jié)果與傳統(tǒng)鑒定方法具有一致性，靈敏度相較于傳統(tǒng)方法更優(yōu)。

Real-time PCR不僅在動(dòng)物纖維定性上表現(xiàn)優(yōu)異，而且在定量領(lǐng)域也表現(xiàn)不俗。吉岡陽(yáng)一郎[13]開發(fā)了一套基于Real-time PCR技術(shù)而用于動(dòng)物毛纖維混合比率的鑒定方法，方法結(jié)果允差符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T 29862規(guī)定。國(guó)內(nèi)在此動(dòng)物纖維定量領(lǐng)域也有一定的研究，Tang等[14]采用Real-time PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)了兩套針對(duì)羊絨和羊毛的探針與引物對(duì)，驗(yàn)證了線粒體12sRNA適合羊毛/羊絨混合物的定性試驗(yàn)，同時(shí)也對(duì)不同比例的樣品及經(jīng)染色整理的樣品的定量進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)稱值一致性很好。

隨著DNA檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟，將可以對(duì)更多的動(dòng)物纖維進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量檢測(cè)分析。

4 難點(diǎn)及展望

DNA檢測(cè)技術(shù)是基于物種DNA序列的特異性，不依賴檢測(cè)人員主觀性，檢測(cè)結(jié)果更加客觀。但目前，DNA技術(shù)在動(dòng)物纖維鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用依然存在一系列問題：

（1）高質(zhì)量DNA的獲取。紡織品一般經(jīng)過較多的前處理及后整理，比如堿處理、染色等，在一定程度上破壞了纖維的DNA結(jié)構(gòu)。

（2）動(dòng)物纖維自身的色素。天然動(dòng)物纖維中所含的色素會(huì)抑制PCR擴(kuò)增的進(jìn)行。

（3）目前DNA定量研究多為二組分混紡產(chǎn)品，正處于起步階段。多組分混紡產(chǎn)品的DNA定量技術(shù)還有待進(jìn)一步研究[15]。

DNA分析檢測(cè)技術(shù)具有非常廣闊的發(fā)展前景，目前已在多領(lǐng)域得到廣泛引用，我們應(yīng)加大在這方面的研究和開發(fā)力度，以提高我國(guó)紡織領(lǐng)域的檢驗(yàn)檢測(cè)水平。

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（作者單位：國(guó)家羊絨產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河北省纖維檢驗(yàn)局）