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        DNA分析技術在動物纖維鑒別領域的研究進展

        2015-11-16 13:24:31董曉東楊素英丁楠
        中國纖檢 2015年17期
        關鍵詞:山羊絨羊絨羊毛

        董曉東++++楊素英++++丁楠++++俞艷彬

        摘要:動物纖維的鑒別屬于紡織品檢測行業(yè)的難題之一,DNA分析技術因其客觀準確性而給動物纖維檢測客觀法帶來了曙光。本文主要綜述了DNA分析技術鑒別動物纖維的研究現(xiàn)狀,介紹了DNA分析技術的原理,并對其應用前景進行了展望。

        關鍵詞:DNA技術;動物纖維;PCR擴增;PCR-RFLP技術;real-time PCR技術

        1 引言

        近幾年來,隨著人們生活水平的提高,天然動物纖維及皮革制品越來越受到消費者的青睞。目前,動物纖維檢測方法主要包括顯微鏡法 [1]和掃描電鏡法[2],二者均通過纖維鱗片形態(tài)特征來對纖維種類進行鑒別。但是,動物纖維的形態(tài)特征會因加工條件、氣候條件及膳食結構等產(chǎn)生變化[3],這就給顯微鏡法的鑒別帶來了困難,而且顯微鏡法對試驗人員的經(jīng)驗要求較高,主觀干擾大,所以相關行業(yè)對客觀性高的檢測方法的需求越來越大。

        近年來,隨著DNA分子技術的逐步成熟,研究人員通過鑒別不同動物的DNA序列信息,實現(xiàn)了動物纖維及其混合物的定性定量,并在逐步完善此技術。DNA分子技術由于其檢測結果的客觀性而廣泛應用于司法、醫(yī)學研究及診斷領域,同以上兩種方法相比,DNA法的檢測結果更加客觀準確。

        2 DNA定性定量原理

        DNA分子,即脫氧核糖核酸,是由堿基、脫氧核糖和磷酸組成的長鏈多聚物。不同的生物所具備的DNA分子在長短和結構上有一定的差異,堿基的排列順序也不盡相同[4]。通過對DNA分子的核苷酸排列順序進行測定即可實現(xiàn)對動物纖維的定性定量檢測。DNA分析檢測技術一般包括以下幾個步驟:

        (1)DNA的提取。動物毛纖維的基因組DNA主要存在于毛囊部分,而紡織類動物纖維一般只取毛干部分,故只能提取毛干線粒體中的DNA。DNA的提取主要包括前處理、分離、純化和濃縮階段。此階段所提取的樣品將直接影響到后續(xù)的擴增及DNA序列的測定,高質(zhì)量的DNA是實現(xiàn)DNA檢測的第一步,因此,提取的DNA樣品應防止其他因素的干擾與污染。

        (2)PCR擴增。PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應,是生物體外特殊的DNA復制反應,能將微量的DNA大幅增加。目標DNA片段經(jīng)過變性、退火、延伸三個基本反應步驟,在數(shù)小時內(nèi)即可擴增放大數(shù)百萬倍。

        (3)DNA序列的測定。DNA序列測定是檢測結果的關鍵所在。通過不同纖維所具備的特異堿基對排列即可實現(xiàn)對纖維的鑒別。目前,Sanger雙脫氧末端終止法在此領域應用較廣,通過電泳和放射自顯影技術對所提取的DNA片段進行測定,即可對纖維品種進行鑒別。

        3 DNA檢測技術在動物纖維鑒別中的研究進展

        隨著DNA分子技術的不斷發(fā)展,其在動物纖維鑒別領域的研究越來越廣。Hamlym P.F.等人在1992年首次制作了綿羊特性DNA探針,實現(xiàn)了對綿羊毛、山羊絨和馬海毛的鑒別[5]。由于當時DNA分子技術水平較低,極大地限制了DNA技術在動物纖維鑒別上的應用。

        PCR擴增技術成功解決了動物纖維基因組中DNA量少、難以提取的問題。Subramanian等[6]提取纖維毛干中線粒體DNA,通過PCR擴增線粒體DNA細胞色素b基因的保守區(qū)域,然后選擇合適的酶切位點分析相應保守區(qū)的單核苷酸多態(tài)性,根據(jù)后片段長度的多態(tài)性成功鑒別出了山羊絨與綿羊毛。PCR-RFLP技術(限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應技術)是一種基于PCR擴增的技術,是目前識別山羊絨和綿羊毛的較好方法之一。但是,PCR-PFLP分析較為復雜,一般只能用來做定性分析,不做定量檢測。在此基礎上,Kirsten等[7]實現(xiàn)了對羊毛、羊絨、駱駝毛、牦牛毛等纖維快速簡便的纖維定性分析,并且比較了清洗、漂白和染色等3步處理工序?qū)NA抽提效果的影響,研究發(fā)現(xiàn)每增加一步處理工序都會明顯降低DNA的提取率,其中染色工序?qū)NA分析的破壞最為嚴重。

        金美菊等[8]針對多種產(chǎn)地的羊絨和羊毛試驗,利用山羊與綿羊質(zhì)檢特定堿基序列的差別,通過設計不同的引物成功實現(xiàn)對純羊絨、羊毛以及羊絨羊毛混合纖維定性鑒別。研究發(fā)現(xiàn)對于純羊絨、純羊毛纖維,采用1組引物(CYTBF/CYTBR)對特定位點特征堿基序列組實現(xiàn)對纖維的鑒別。對于羊絨羊毛混合物,采用羊絨引物(YM1_F/C7YGR1)和羊毛引物(YM1_F/W10YGR1)對混合纖維進行定性鑒別。通過對羊毛、羊絨引物的設計,有效地提高了檢測的靈敏度。

        相比DNA直接測序法和PCR-RFLP法,Real-time PCR(實時熒光PCR技術)具有簡單、準確、快速的特點[9]。Real-time PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累計實時監(jiān)測整個PCR過程,最終通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。費靜等[10]設計針對兔和狐線粒體12SrRNA基因的特異性TaqMan探針和引物對,建立了兔毛纖維和狐貍毛纖維的鑒別方法,此方法特異性較好,并且靈敏度達到了1%,并且在驗證實例中得到滿意的結果。紫山羊絨與牦牛毛在顯微鏡下外觀形態(tài)極其相似,非常難以鑒別,Lu等[11]設計針對牦牛毛和紫山羊絨12SrRNA基因的TaqMan探針和引物對,建立了牦牛毛纖維和紫山羊絨纖維的鑒別法,分別對染色和漂白樣品分別進行鑒別,鑒別結果也十分滿意,靈敏度也達到了1%。陳國培等[12]建立羊毛羊絨熒光PCR檢測體系,并對檢測方法特異性和檢出限進行分析,結果表明此方法特異性好,檢出限為10ngDNA,同時對16個樣品進行驗證檢測,結果與傳統(tǒng)鑒定方法具有一致性,靈敏度相較于傳統(tǒng)方法更優(yōu)。

        Real-time PCR不僅在動物纖維定性上表現(xiàn)優(yōu)異,而且在定量領域也表現(xiàn)不俗。吉岡陽一郎[13]開發(fā)了一套基于Real-time PCR技術而用于動物毛纖維混合比率的鑒定方法,方法結果允差符合標準GB/T 29862規(guī)定。國內(nèi)在此動物纖維定量領域也有一定的研究,Tang等[14]采用Real-time PCR技術,設計了兩套針對羊絨和羊毛的探針與引物對,驗證了線粒體12sRNA適合羊毛/羊絨混合物的定性試驗,同時也對不同比例的樣品及經(jīng)染色整理的樣品的定量進行了研究,試驗結果與標稱值一致性很好。

        隨著DNA檢測技術的不斷成熟,將可以對更多的動物纖維進行準確的定性和定量檢測分析。

        4 難點及展望

        DNA檢測技術是基于物種DNA序列的特異性,不依賴檢測人員主觀性,檢測結果更加客觀。但目前,DNA技術在動物纖維鑒別領域的應用依然存在一系列問題:

        (1)高質(zhì)量DNA的獲取。紡織品一般經(jīng)過較多的前處理及后整理,比如堿處理、染色等,在一定程度上破壞了纖維的DNA結構。

        (2)動物纖維自身的色素。天然動物纖維中所含的色素會抑制PCR擴增的進行。

        (3)目前DNA定量研究多為二組分混紡產(chǎn)品,正處于起步階段。多組分混紡產(chǎn)品的DNA定量技術還有待進一步研究[15]。

        DNA分析檢測技術具有非常廣闊的發(fā)展前景,目前已在多領域得到廣泛引用,我們應加大在這方面的研究和開發(fā)力度,以提高我國紡織領域的檢驗檢測水平。

        參考文獻:

        [1]GB/T 16988—2013 特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定[S].

        [2]GB/T 14593—2008 山羊絨、綿羊毛及其混合纖維定量分析方法 掃描電鏡法[S].

        [3]陳啟龍, 唐鑫省.生物芯片技術及其應用前景[J].資源開發(fā)與市場,2007,23(8): 725-727.

        [4]陳永青, 謝建平, 謝君,等. DNA科學導論[M]. 北京:科學出版社,2005: 29.

        [5]P.F.Hamlyn, G. Nelson,and B.J. McCarthy. Wool-fiber Identification by means of Novel Species-specific DNA probes[J]. J.Text.Inst.,1992,83: 97-103.

        [6]Selvis Subramanian,T Karthik,N N Vijayaraaghavan. Single nucleotide polymorphism for animal fiber identification[J]. Journal of biotechnology, 2005, 116(2): 153-158.

        [7]Kirsten Kerkhoff,Gabriel Cescutti,Lothar Kruse,et al..Development of a DNA-analytical method for the identification of animal hair fibers in textiles[J].Textile research journal,2009,79(1):69-75.

        [8]金美菊, 阮勇, 李翔,等. 基于基因技術的羊絨與羊毛纖維定性鑒別方法[J].紡織學報, 2012, 33(8): 19-23.

        [9]賈興旺,田亞平. 雙重實時熒光PCR與DNA測序分析及PCR-RFLP方法檢測白細胞介素-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性方法的比較研究[J]. 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2008, 23(5): 6-8.

        [10]費靜, 董正廉, 周輝,等. 基于熒光定量PCR的兔毛、狐貍毛纖維定性檢測方法[J]. 標準與測試, 2012, 40(11): 56-58.

        [11]W.m. Lu, J. Fei,J. Yang,et al. A novel method to identify yak fiber in textile[J].Textile Research Journal,2012,83(8): 773-779.

        [12]陳國培, 賴心田, 唐富潤,等. 羊毛及羊絨制品實時熒光PCR鑒定方法研究[J]. 紡織導報, 2013,(2): 88-91.

        [13]吉岡陽一郎.動物毛纖維制品中的動物毛纖維混合比率的鑒定方法[P].中國:03824723.2, 2005,11.

        [14]M.F. Tang,W.P. Zhang,and H. Zhou. A real-time PCR method for quantifying mixed cashmere and wool based on hair mitochondrial DNA[J].Textile Research Journal,2014,84(15):1612-1621.

        [15]張小莉, 池海濤, 張經(jīng)華,等.羊絨和羊毛纖維檢測技術研究進展[J].毛紡科技, 2009,37(3): 56-59.

        (作者單位:國家羊絨產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,河北省纖維檢驗局)

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