龍燕 王葉芳

（1.中國藥科大學藥理教研室，江蘇南京 210009；2.南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院兒科，江蘇南京 210014）

麻杏石甘湯對肺炎支原體誘導巨噬細胞凋亡的保護作用

龍燕1王葉芳2

（1.中國藥科大學藥理教研室，江蘇南京 210009；2.南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院兒科，江蘇南京 210014）

目的：觀察麻杏石甘湯對肺炎支原體（MP）誘導巨噬細胞凋亡的保護作用。方法：培養(yǎng)巨噬細胞RAW246.7，分別將麻杏石甘湯1、5、10、20μL與巨噬細胞共孵育，模型組與空白對照組分別加入磷酸鹽緩沖液（PBS）20μL與細胞共孵育。除空白對照組，72h后利用滅活MP感染其余各組細胞24h。通過MTT檢測各組細胞活力，LDH檢測細胞損傷率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果：與空白對照組比較，模型組細胞活力顯著降低（P＜0.05），LDH釋放、細胞凋亡百分比顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯10μL與20μL組細胞活力顯著提高（P＜0.05），LDH釋放、細胞凋亡百分比顯著降低（P＜0.05）。結論：麻杏石甘湯能對抗MP引起的RAW246.7細胞活力下降，抑制MP誘導的RAW246.7細胞凋亡，對細胞具有明顯的保護作用。

麻杏石甘湯 巨噬細胞 細胞凋亡 細胞活力 體外實驗

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童呼吸道感染較常見的病原體，其發(fā)病率在嬰幼兒中有逐年升高的趨勢。麻杏石甘湯是辨證治療痰熱閉肺型肺炎支原體肺炎（mycoplasmal pneumoniae pneumonia，MPP）的常用方劑，經(jīng)臨床驗證療效確切［1］。課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯可降低MP感染后巨噬細胞內(nèi)TNF-α蛋白水平的表達［2］。本研究通過體外培養(yǎng)巨噬細胞RAW246.7細胞株，給予麻杏石甘湯預孵育后感染滅活MP，觀察細胞活力及細胞凋亡水平的變化，現(xiàn)將結果報道如下。

1 實驗材料

1.1 藥品、菌株與試劑MP菌株29342（ATCC，M129-B7）。麻杏石甘湯，藥物組成：麻黃、杏仁、石膏、甘草（1∶3∶6∶2），內(nèi)含生藥0.36g/mL，由南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院藥劑科提供。DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibcol，USA）；胎牛血清（Gibcol，USA）；3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，sigma-Aldrich，USA）；二甲基亞砜（DMSO，Gibcol，USA）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（南京建成生物制品有限公司）；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（thermo，USA）。

1.2 儀器DG3033A型酶聯(lián)免疫儀（華東電子管廠）；XSZ-D倒置生物顯微鏡（重慶光學儀器廠）；BB-16型二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus），XIDP超凈工作臺（蘇州吳縣實驗動物儀器廠）；FACS Calibur流式細胞儀（美國BD）。

2 實驗方法

2.1 MP菌株培養(yǎng)MP菌株培養(yǎng)于支原體肉湯培養(yǎng)基中。解凍培養(yǎng)基至溶液變黃時進行MP菌落培養(yǎng)，約12d形成荷包蛋樣菌落，隨機挑取一個菌落加入支原體肉湯后，37℃5%CO2，800r/min×72h培養(yǎng)，收集菌液，調(diào)整濃度至106～107CFU/mL。

2.2 巨噬細胞RAW246.7培養(yǎng)及分組DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW246.7細胞株，待細胞密度達到60%后，將細胞接種于96與24孔板內(nèi)，并分為以下組別：空白對照組，加入20μL磷酸鹽緩沖液（PBS）；模型組，給予20μL PBS，72h后加入滅活MP（滅活條件：將MP菌株暴露于紫外線中2h）10μL；麻杏石甘湯各劑量給藥組，分別以麻杏石甘湯1、5、10、20μL與細胞共孵育72h后，給予滅活MP菌株。

2.3 檢測指標培養(yǎng)24h后，各組采用MTT檢測細胞活力，LDH試劑盒檢測LDH水平，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

2.3.1 細胞活力測定（MTT法）MTT可以被活細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原成難溶性的藍紫色結晶并沉積在細胞體內(nèi)，但是死亡細胞內(nèi)的MTT不能被還原。DMSO可以溶解這些紫色結晶，通過測定570nm波長下吸光度不同，可以檢測細胞活力。配制MTT至終濃度為5mg/mL工作液。向96孔板每孔加入50μL MTT工作液。待反應4h后，吸去上清液（注意避免吸走甲瓚結晶），每孔加入200μL的DMSO，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，以DMSO調(diào)零，測定570nm處的光密度值（OD），以空白對照組的OD值為100%，計算各給藥組RAW246.7細胞活力。

2.3.2 LDH活性測定及抑制率計算收集24孔板內(nèi)每孔培養(yǎng)液0.5mL，按照乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒使用說明書的步驟，測定細胞培養(yǎng)液的LDH活性，再根據(jù)下式計算各組LDH抑制率。

LDH抑制率=（模型組LDH含量-給藥組LDH含量）/（模型組LDH含量-空白對照組LDH含量）

2.3.3 Annexin V與PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書，PBS洗滌細胞后，用雙蒸水1∶4稀釋結合緩沖液，以稀釋的結合緩沖液重懸細胞，并調(diào)細胞密度為2×105個/mL，取195μL細胞懸液，加5μL Annexin V-FITC和10μL PI混勻，室溫避光反應30min，上機檢測。

2.4 統(tǒng)計學方法使用Stata（Version 10.0，Stata-Corp，LP）軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用的分析方法為單因素方差分析及兩兩比較（Scheffe test），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

結果表明，MP感染RAW246.7細胞后，與空白對照組相比，模型組的細胞活力顯著下降，細胞外LDH釋放顯著上升，細胞凋亡率顯著增高；與模型組相比，麻杏石甘湯10μL與20μL組細胞活力顯著上升，細胞外LDH釋放顯著下降，細胞凋亡率顯著降低。見表1、圖1。

表1 各組細胞活力、細胞外LDH含量及LDH抑制率、細胞凋亡率比較

圖1 細胞凋亡檢測圖譜

4 討論

支原體肺炎發(fā)病機制目前尚不明確，現(xiàn)認為感染后MP與機體免疫系統(tǒng)相互作用，導致多克隆促進T細胞與B細胞增殖，激活巨噬細胞、NK細胞與細胞毒T細胞的溶細胞活力，刺激淋巴細胞、巨噬細胞及單核細胞產(chǎn)生細胞因子，造成組織損傷［3］。有文獻報道，呼吸道MP感染患者血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平明顯增高［4］。TNF-α主要由巨噬細胞產(chǎn)生，可明顯促進白介素8（IL-8）含量升高，而IL-8可趨化白細胞至炎癥部位，加重組織損傷；亦可通過T細胞、B細胞調(diào)節(jié)機體的特異性及非特異性免疫功能，誘導中心粒細胞的趨化作用和局部浸潤，損傷內(nèi)皮細胞，降低細胞跨膜電位，誘發(fā)其他炎性介質釋放；高水平TNF-α可促進B細胞合成過多的IgE，使機體出現(xiàn)高敏狀態(tài)和I型變態(tài)反應［5-8］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，MP可誘導巨噬細胞凋亡［9］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，MP可誘導巨噬細胞發(fā)生凋亡，細胞活力顯著下降，細胞外LDH活力顯著上升。LDH是機體能量代謝中的一種重要酶，主要存在于細胞內(nèi)，屬胞漿酶，細胞破裂時LDH釋放到基質中，測定LDH活性可以推斷細胞損傷程度。不同體積的麻杏石甘湯預處理細胞后，10μL及20μL麻杏石甘湯可顯著降低由MP誘導的巨噬細胞凋亡率，提高細胞活力并同時降低細胞外LDH活力，但麻杏石甘湯1μL及5μL未顯示出對細胞的保護作用，這可能由于麻杏石甘湯有效濃度過低所致。上述結果提示，MP可誘導巨噬細胞發(fā)生凋亡，麻杏石甘湯則對巨噬細胞具有保護作用。吞噬清除損傷細胞是巨噬細胞的重要生理功能，同時巨噬細胞可釋放大量TNF-α參與調(diào)節(jié)機體細胞免疫。因此，當機體感染MP后，在疾病的后期由于大量巨噬細胞發(fā)生凋亡，細胞內(nèi)大量TNF-α被釋放至細胞外，炎癥加重。而麻杏石甘湯通過抑制MP誘導的巨噬細胞凋亡，提高巨噬細胞活力，是其能夠有效輔助治療MP的主要機制之一。同時，本實驗結果提示，麻杏石甘湯的有效濃度與其對巨噬細胞的保護作用有相關性，但是否在輔助治療MP感染時，麻杏石甘湯濃度越高其療效就越好仍需進一步驗證。并且，麻杏石甘湯通過何種機制調(diào)節(jié)巨噬細胞凋亡仍需深入研究。

綜上所述，本實驗為麻杏石甘湯通過調(diào)節(jié)機體免疫達到輔助治療MP提供了有力證據(jù)，且由于其對巨噬細胞具有保護作用，可推測麻杏石甘湯在其他炎癥疾病中也可能發(fā)揮有效治療作用。

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編輯：吳寧

R289.51

A

1672-397X（2015）10-0074-03

龍燕（1978—），女，博士，講師，主要研究方向：藥理學及神經(jīng)生物學。

王葉芳，本科學歷，副主任醫(yī)師。wangyefang@126.com

2015-07-01