朱 偉，張曉莉，劉 洋，王小花，李玉婷

（牡丹江醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，黑龍江 牡丹江 157011）

魚鱗膠原蛋白提取及對成纖維細(xì)胞功能的影響

朱 偉，張曉莉，劉 洋，王小花，李玉婷

（牡丹江醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，黑龍江 牡丹江 157011）

通過水提法提取魚鱗膠原蛋白，分離大鼠皮膚成纖維細(xì)胞，觀察魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞增殖，細(xì)胞內(nèi)血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）mRNA表達(dá)、蛋白合成及cGMP含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：魚鱗膠原蛋白可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到40mg/L時，增值率可達(dá)42.75%；魚鱗膠原蛋白能通過促進(jìn)cGMP合成，明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞PDGF、TGFβmRNA表達(dá)及蛋白合成，當(dāng)質(zhì)量濃度為40mg/L時，PDGF、TGFβmRNA表達(dá)量分別為對照組的1.514±0.047和1.595±0.032倍。水提法提取的魚鱗膠原蛋白具有良好的相容性，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及活化，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

魚鱗膠原蛋白；成纖維細(xì)胞；傷口愈合

皮膚損傷創(chuàng)面治療是臨床常見問題，促進(jìn)創(chuàng)面愈合并提高愈合質(zhì)量一直是研究的熱點。創(chuàng)傷修復(fù)是由多種細(xì)胞、因子參與且相互作用的復(fù)雜過程；膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)重要的組成成分，不僅是基質(zhì)的骨架蛋白，同時也可促進(jìn)細(xì)胞遷移、細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)傷口愈合［1］。Chai等［2］發(fā)現(xiàn)：將熒光標(biāo)記的魚鱗膠原蛋白置于小鼠皮膚表面，魚鱗膠原蛋白可透過皮膚角質(zhì)層，并可活化成纖維細(xì)胞，增強(qiáng)皮膚的彈性及保濕性。Kempf等［3］將膠原蛋白變性后與角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞黏附和增殖。目前，天然膠原蛋白主要來源于畜類及禽類動物組織，但由于瘋牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆發(fā)，使陸生哺乳動物膠原蛋白的安全性普遍受到質(zhì)疑［4］。

我國水產(chǎn)品豐富，在加工魚產(chǎn)品時會產(chǎn)生大量下腳料，其中魚鱗約占總質(zhì)量5%，通常被當(dāng)作垃圾丟棄，每年被丟棄的魚鱗約有30萬t［4］。本室的前期工作表明：魚鱗膠原蛋白可清除氧自由基，提高SOD、CAT含量［5］，并可促進(jìn)免疫功能低下小鼠傷口愈合［6］，具有較好的生物學(xué)活性。為探討魚鱗膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合機(jī)制，本文提取魚鱗膠原蛋白，以觀察膠原蛋白對成纖維增殖、細(xì)胞因子分泌的影響，以期為魚鱗膠原蛋白開發(fā)利用及損傷修復(fù)治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

魚鱗取自超市生鮮部魚類加工處，為新鮮的各種魚鱗混合物。3日齡內(nèi)Wsitar乳鼠，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，引物由上海生工生物工程有限公司合成，SYBR Premix Ex TaqTM為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 魚鱗膠原蛋白膜制備

新鮮魚鱗清水沖洗→烘干→體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸溶液脫鈣→清水、蒸餾水沖洗→調(diào)pH→烘干，備用。取適量經(jīng)處理魚鱗，搗碎，按體積比1∶30比例加入蒸餾水，100℃水浴30min，80℃水浴1.5 h，4℃、8 000r/min離心20min，取上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾除菌后，于超凈臺內(nèi)自然干燥后即得魚鱗膠原蛋白膜。采用對二甲基氨基苯甲醛比色法測定膠原蛋白特征氨基酸—羥脯氨酸的含量，測得值×11.1即為膠原蛋白的量。

提取率=提取的膠原蛋白量/魚鱗中總的膠原蛋白量×100%

1.2.2 魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響

取3日齡內(nèi)的Wsitar乳鼠背部皮膚，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%中性蛋白酶溶液，4℃酶解消化過夜，分離真皮、表皮。將真皮部分加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的Ⅰ型膠原酶37℃酶解消化1 h。PBS溶液洗滌離心、用孔徑為74 μm的細(xì)胞篩過濾去除基質(zhì)成分，得到的細(xì)胞為大鼠真皮成纖維細(xì)胞［7］。

取適量無菌膠原蛋白膜，用1640培養(yǎng)液溶解制成質(zhì)量濃度為5、10、20、40和80mg/L液體，與生長狀態(tài)良好的大鼠真皮成纖維細(xì)胞4×103個共同培養(yǎng)于96孔板中，未加膠原蛋白孔為空白對照。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液（5g/L）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩10min，于490 nm處檢測吸光度（A）值。增殖率E按以下公式計算。E=（A樣品-A0）/A0×100% （A0為空白對照組吸光度值；A樣品為膠原蛋白組吸光度值）。

1.2.3 魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細(xì)胞PDGF、TGFβ mRNA表達(dá)的影響

將生長狀態(tài)良好的大鼠真皮成纖維細(xì)胞2×105mL-1與魚鱗膠原蛋白40mg/L共同培養(yǎng)于6孔板中，未加膠原蛋白孔為空白對照。培養(yǎng)4、8和24 h后收集細(xì)胞，利用Trizol試劑法提取RNA。取1 μg RNA利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶法合成cDNA。Real time PCR采用SYBR Green染料法，PDGF上游引物為5′-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3′，下游引物為5′-TTGGCCACCTTGACGCTGCCG-3′。TGFβ上游引物為5′-GCTAATGTTGTTGCCCTCCTAC-3′，下游引物為5′-GGACTTTGGTGTGTTGAGTGTC-3′。PCR反應(yīng)條件：50℃、2min，94℃、10min，1循環(huán)；94℃、15 s，60℃、1min，40循環(huán)。以GADH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細(xì)胞PDGF、TGFβ蛋白表達(dá)的影響

將生長狀態(tài)良好的大鼠真皮成纖維細(xì)胞2× 105mL-1與魚鱗膠原蛋白40mg/L共同培養(yǎng)于6孔板中，未加膠原蛋白孔為空白對照。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌2次后，溶于裂解液中，冰上放置30min，4℃、12 000r/min離心10min，利用BCA蛋白測定試劑盒定量蛋白。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜經(jīng)含質(zhì)量濃度為50g/L脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，加入抗PDGF、TGFβ、GAPDH抗體，4℃過夜，TBST洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，共同孵育2 h，利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。以GADPH為內(nèi)參基因，目的蛋白相對含量以目的蛋白光密度值與內(nèi)參光密度的比值來表示。

1.2.5 魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細(xì)胞cGMP含量的影響

將生長狀態(tài)良好的大鼠真皮成纖維細(xì)胞2× 105mL-1與魚鱗膠原蛋白40mg/L共同培養(yǎng)于6孔板中，未加膠原蛋白孔為空白對照，培養(yǎng)2、4和8 h后收集細(xì)胞，用直接加熱法制備cGMP待測樣品，通過試劑盒、利用125I同位素標(biāo)記競爭蛋白結(jié)合放射免疫法測定cGMP含量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件，通過t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.01為差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚鱗膠原蛋白膜的制備

目前常用的膠原蛋白提取方法有水提法、酸法、堿法和酶法等，主要的方法為酸法及酶法，但該提取方法繁瑣、時間長，成本高，且大量腐蝕性物質(zhì)對生產(chǎn)設(shè)備要求較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。本室前期工作表明［5］：與酸法相比，水提法同樣可以有效地提取魚鱗膠原蛋白，故本研究采用水提法提取魚鱗膠原蛋白，提取率為64.5%，且提取的膠原蛋白呈膜性良好，所制的膠原蛋白膜見圖1。

圖1 魚鱗膠原蛋白膜Fig.1 Fish scale collagenmembrane

2.2 魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞增殖的影響

成纖維細(xì)胞是構(gòu)成肉芽組織的主要成分之一，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補(bǔ)傷口組織缺損，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件。成纖維細(xì)胞還可分泌TGFβ、PDGF、FGF等多種細(xì)胞因子，通過多途徑參與修復(fù)過程。本研究前期工作表明：魚鱗膠原蛋白可促進(jìn)免疫低下小鼠傷口愈合［7］，為探討魚鱗膠原蛋白作用機(jī)制，本研究分離大鼠乳鼠皮膚成纖維細(xì)胞，體外觀察其對成纖維細(xì)胞功能的影響。首先觀察對成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)魚鱗膠原蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到40、80mg/L時，增值率分別可達(dá)42.75%、44.36%。

圖2 魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of fish scale collage on proliferation of fibroblast cell

2.3 魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞TGFβ mRNA表達(dá)及蛋白合成的影響

TGFβ是促進(jìn)傷口愈合的重要調(diào)控因子，活化的TGFβ可趨化成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞向傷口處聚集，并且TGFβ可活化成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，促進(jìn)IL-1、PDGF、TGF生成，促進(jìn)整合素，膠原蛋白、彈力蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)合成，增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用［8］。為探討魚鱗膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制，觀察魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞TGFβ mRNA表達(dá)及蛋白合成的影響。結(jié)果表明：膠原蛋白40mg/L與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)8 h即可明顯促進(jìn)TGFβ mRNA表達(dá)，mRNA相對表達(dá)量可達(dá)1.595±0.032（圖3），并可促進(jìn)蛋白合成（圖4）。

圖3 魚鱗膠原蛋白對TGFβ mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of fish scale collage on TGFβ mRNA expression

圖4 魚鱗膠原蛋白對TGFβ蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of fish scale collage on TGFβ protein expression

2.4 魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞PDGF mRNA表達(dá)及蛋白合成的影響

PDGF是第一個批準(zhǔn)臨床用于治療皮膚損傷的細(xì)胞因子，Nagai等［9］、Mandracchia等［10］用Becaplermin（重組人PDGF）治療糖尿病患者的皮膚潰瘍，發(fā)現(xiàn)Becaplermin可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、增殖，促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)傷口愈合。為探討魚鱗膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制，觀察魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞PDGF mRNA表達(dá)及蛋白合成的影響。結(jié)果表明：膠原蛋白40mg/L與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)8 h即可明顯促進(jìn)PDGF mRNA表達(dá)，mRNA相對表達(dá)量可達(dá)1.514±0.047（圖5），并可促進(jìn)蛋白合成（圖6）。

圖5 魚鱗膠原蛋白對PDGF mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effects of fish scale collage on PDGF mRNA expression

圖6 魚鱗膠原蛋白對PDGF蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of fish scale collage on PDGF protein expression

2.5 魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞cGMP含量的影響

cGMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，可活化多種胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，與細(xì)胞分裂、增殖及活化密切相關(guān)。成纖維細(xì)胞內(nèi)cGMP活化可使細(xì)胞合成大量膠原蛋白。上述實驗表明：魚鱗膠原蛋白可促進(jìn)成纖維細(xì)胞TGFβ、PDGF mRNA表達(dá)及蛋白合成，為探討對胞內(nèi)信號通路的影響，觀察魚鱗膠原蛋白對cGMP含量的影響。結(jié)果表明：魚鱗膠原蛋白40mg/L可使成纖維細(xì)胞內(nèi)cGMP含量明顯增多，作用8 h，可使cGMP含量達(dá)到（1.321±0.097）pmol/mL（圖7）。

3 結(jié)論

水提法提取的魚鱗膠原蛋白具有良好的生物相容性，可以劑量依賴的方式促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到40mg/L時，增值率可達(dá)42.75%，并可通過誘導(dǎo)cGMP合成，活化cGMP介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞TGFβ、PDGF mRNA表達(dá)及蛋白合成。結(jié)果表明：水提法提取的魚鱗膠原蛋白具有良好的生物相容性及促進(jìn)成纖維細(xì)胞功能活性的作用，其臨床應(yīng)用價值值得進(jìn)一步深入研究。

圖7 魚鱗膠原蛋白對cGMP合成的影響Fig.7 Effect of fish scale collage on cGMP protein expression

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（責(zé)任編輯 周曉薇）

Effect of fish scale collagen on fibroblast function

ZHU Wei，ZHANG Xiaoli，LIU Yang，WANG Xiaohua，LI Yuting
（Department of Immunology，School of Basic Medical Sciences，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China）

Water-soluble collagens were isolated from fish scale，and the effect of fish scale collagen on fibroblast proliferation，PDGF and TGFβ mRNA expression，and the concentration of cGMP were studied. The results showed that the proliferation of fibroblasts was upregulated in a dose-dependent manner，and the relative growth rate was increased 42.75%treated with scale collagen（40mg/L）PDGF，TGFβ mRNA expression and protein production were significantly promoted，and treating with scale collagen（40mg/L），the relative mRNA expression of PDGF and TGFβ were increased 1.514±0.047 and 1.595± 0.032.Water-soluble fish scale collagen were biocompatible，could enhance fibroblast cell activity，and would be favorable as wound healing material.

fish scale collagen；fibroblast；wound healing

R285.5

A

1672-3678（2015）02-0053-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.010

2014-09-19

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12531748）

朱 偉（1971—），女，浙江省紹興市人，博士，副教授，研究方向：免疫藥理學(xué)，E-mail：zhuzwwei@163.com