張 瑞，周 俊，2，王舒雅，2，沈立真，陳怡露，鄭 濤，2，雍曉雨，2

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物能源研究所，江蘇 南京 211800）

產(chǎn)γ-聚谷氨酸菌株的誘變選育及其種子液工藝優(yōu)化

張 瑞1，周 俊1，2，王舒雅1，2，沈立真1，陳怡露1，鄭 濤1，2，雍曉雨1，2

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物能源研究所，江蘇 南京 211800）

以已篩選的1株產(chǎn)γ-多聚谷氨酸解淀粉芽胞桿菌C1為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外線-亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變，并運(yùn)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)誘變菌株的種子培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)復(fù)合誘變選育得到1株能夠穩(wěn)定遺傳的正突變菌株C1-6，其搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量由18.4 g/L提高到24.2 g/L，增加了31.5%，且傳代8次后仍能保持穩(wěn)定。通過(guò)單因子試驗(yàn)篩選到玉米粉和黃豆粉作為C1-6生長(zhǎng)的C源和N源。正交試驗(yàn)后，C1-6在成分為K2HPO41.0 g/L、MgSO40.5 g/L、黃豆粉15.0 g/L、玉米粉5.0 g/L，pH 6.5的培養(yǎng)基中，37℃、裝液量1/5（150 mL三角瓶裝液30 mL）的培養(yǎng)條件下可獲得較大的生物量，OD600達(dá)到6.31。

復(fù)合誘變；γ-多聚谷氨酸；種子液；正交試驗(yàn)；優(yōu)化

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由某些微生物利用D-和/或L-型谷氨酸單體聚合而成的一種水溶性高分子氨基酸聚合物［1］。γ-PGA分子中有大量游離的親水性羧基，可在分子內(nèi)部或分子之間形成氫鍵，具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保濕和黏接等功能特性，因此γ-PGA及其衍生物在食品、化工、材料和醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景［2］。

γ-PGA通過(guò)α-氨基和γ-羧基之間形成的γ-酰胺鍵聚合而成［3］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，很難通過(guò)化學(xué)方法合成，因此目前獲得γ-PGA最有效的途徑是通過(guò)微生物發(fā)酵［4］。然而目前國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，從自然界中篩選的野生菌株合成γ-PGA的產(chǎn)量通常較低。例如Atsuo等［5］發(fā)現(xiàn)Bacillus subtilis IFO3335在含有檸檬酸和谷氨酸的培養(yǎng)基中γ-PGA的產(chǎn)量?jī)H 為 9.6 g/L，Ashiuchi等［6］發(fā) 現(xiàn) B.subtilis subsp.chungkookjang在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%谷氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，γ-PGA的產(chǎn)量?jī)H能達(dá)到13.5 g/L。因此選育高產(chǎn)菌種、降低生產(chǎn)成本是解決γ-PGA難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)問(wèn)題的關(guān)鍵。

在微生物誘變育種中，可利用各種物理、化學(xué)誘變因素來(lái)處理菌種。對(duì)野生型菌株使用單誘變因素有時(shí)也能取得好的效果，但對(duì)既往誘變史復(fù)雜的菌株單一誘變因素重復(fù)使用突變的效果不佳，這時(shí)可利用復(fù)合誘變因素處理菌種，擴(kuò)大誘變幅度，提高誘變效果。

工業(yè)中廣泛應(yīng)用的菌株改良的方法是對(duì)菌株進(jìn)行誘變和選育［7］，其中，常常利用紫外線（UV）［8-9］和亞硝基胍（NTG）［10-11］對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行誘變。

本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室已篩選的產(chǎn)γ-PGA菌株C1為出發(fā)菌株，利用UV和NTG對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變，選育出1株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)γ-PGA突變株，并利用搖瓶試驗(yàn)對(duì)突變株的種子液培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 誘變出發(fā)菌株

Bacillus amyloliquefaciens C1，由南京工業(yè)大學(xué)生物能源研究所分離和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面保存培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 10、瓊脂20；pH 7.0。

LB液體培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 10；pH 7.0。

固體篩選培養(yǎng)基（g/L）：檸檬酸10、谷氨酸10、NH4Cl 6、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeCl3·6H2O 0.02、CaCl20.2、MnSO4·H2O 0.05、瓊脂20；pH 7.2。

液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）：檸檬酸13.5、谷氨酸10、NH4Cl 6.8、甘油75、K2HPO41、MgSO4· 7H2O 0.5、FeCl3·6H2O 0.02、CaCl20.2、MnSO4·H2O 0.05；pH 7.2。

C源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （g/L）：（NH4）2SO42.0、NaH2PO40.5、K2HPO40.5、MgSO4·7H2O 0.2、CaCl20.1。

N源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （g/L）：KH2PO41.36、Na2HPO42.13、MgSO4·7H2O 0.2、CaCl20.1、FeSO4· 7H2O 0.000 5、葡萄糖10。

1.1.3 主要試劑

培養(yǎng)基所用試劑（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。亞硝基胍（以配制10 mg/mL的NTG為例）：稱(chēng)取20 mg NTG于5 mL滅菌的離心管中，滴加1 mL丙酮使NTG充分溶解，再加入1 mL、pH 6.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，充分混勻。

1.1.4 主要儀器

ENP-9080BS-Ⅱ型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-DJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；NDJ-5S數(shù)字式黏度計(jì)，上海精密儀器有限公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；HYG-C型恒溫振動(dòng)培養(yǎng)器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Freezemobile 35 L型冷凍干燥儀，美國(guó)VIRTIS公司；EYALA DSB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；Biochrom 30全自動(dòng)氨基酸分析儀，英國(guó)Biochrom公司；單人單面紫外誘變臺(tái)（垂直）超凈工作臺(tái)，濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

出發(fā)菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下170 r/min培養(yǎng)48 h，每隔2 h（培養(yǎng)32 h后每隔4 h）用分光光度計(jì)于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD600，以滅菌的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.2.2 菌懸液的制備

離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌、離心3次，再將菌體懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，加入玻璃珠振蕩15 min，使菌體分散并使成單細(xì)胞，菌懸液濃度約為1×108個(gè)/mL。

1.2.3 紫外致死率

打開(kāi)紫外燈（功率15 W、波長(zhǎng)254 nm）預(yù)熱20 min。向直徑為90 mm培養(yǎng)皿中加入10 mL菌株C1的菌懸液，將培養(yǎng)皿置于距紫外線光源30 cm（垂直距離）的磁力攪拌器上，照射1 min后打開(kāi)培養(yǎng)皿，同時(shí)磁力攪拌器攪拌，并開(kāi)始計(jì)算時(shí)間。處理時(shí)間分別設(shè)置為10、20、30、40、60和100 s，照射結(jié)束后于黑暗處?kù)o置0.5 h。以未經(jīng)紫外處理的菌液為對(duì)照。將處理和對(duì)照的菌液用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后，涂布于LB培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，30℃避光靜置培養(yǎng)24～36 h，統(tǒng)計(jì)觀察菌落數(shù)。計(jì)算不同誘變劑量的致死率，制作存活曲線。致死率在90%左右的紫外照射時(shí)間作為隨后復(fù)合誘變的劑量。存活率=誘變后的菌數(shù)/誘變前的菌數(shù)× 100%；致死率=1-存活率。

1.2.4 亞硝基胍（NTG）致死率

準(zhǔn)確吸取菌懸液2 mL，加入已滅菌的試管中，按V（菌懸液）∶V（NTG）=1∶1的比例進(jìn)行混合，使混合液中NTG的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg/mL，將試管置于搖床中，在30℃下100 r/min處理30 min。處理結(jié)束后，將菌懸液6 000 r/min離心5 min，棄上清液，用滅菌的生理鹽水洗滌菌體3次，終止反應(yīng)。以滅菌的生理鹽水適當(dāng)稀釋各處理的菌液，涂布于選擇性培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24～36 h，統(tǒng)計(jì)觀察菌落數(shù)。同時(shí)以不加NTG為對(duì)照。培養(yǎng)數(shù)天后，平板計(jì)數(shù)法計(jì)算各處理組的存活率和致死率，致死率在90%左右的NTG濃度作為隨后復(fù)合誘變的劑量。

1.2.5 復(fù)合誘變初篩

復(fù)合誘變實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路參照文獻(xiàn)［12］，處理方法見(jiàn)表1。UV處理和NTG處理見(jiàn)1.2.3和1.2.4。

誘變處理后，將菌懸液6 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用滅菌的生理鹽水洗滌菌體3次，終止反應(yīng)。以滅菌的生理鹽水適當(dāng)稀釋各處理的菌液，涂布于選擇性培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24～36 h，從平板上挑選黏度較大的菌落，劃線接種到固體篩選培養(yǎng)基上，檢查其特征是否一致，直到獲得純培養(yǎng)。將獲得的突變株接種于斜面培養(yǎng)基上，4℃保存，每隔1個(gè)月轉(zhuǎn)接活化1次。

1.2.6 液體發(fā)酵液黏度測(cè)定

從接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保存的菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下170 r/min培養(yǎng)16 h，按5%接種量接種到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min搖床培養(yǎng)48 h后用NDJ-5S型數(shù)字式黏度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液黏度，以出發(fā)菌株黏度值為標(biāo)準(zhǔn)，挑選黏度較大的突變株。

1.2.7 γ-PGA提取與純化

發(fā)酵液10 000 r/min離心30 min后，取上清液，加入4倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，12 000 r/min離心，沉淀用去離子水溶解后，去離子水透析過(guò)夜，冷凍干燥得到固體初提物。初提物用去離子水溶解，12 000 r/min離心，上清加20 mg/mL蛋白酶K，去離子水透析過(guò)夜，再按上述方法離心，取上清液冷凍干燥，得到γ-PGA固體純化樣品，-70℃保存。

1.2.8 產(chǎn)物水解

取純化的γ-PGA樣品0.2 g放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl，抽真空，維持1 min后封口，110℃水解24 h，冷卻后過(guò)濾，再用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀濃縮，洗提3次，最后定容到10 mL，每一步均采用超純水進(jìn)行處理。取最終定容的濾液分析游離谷氨酸含量。

1.2.9 水解產(chǎn)物氨基酸分析

采用Biochrom 30全自動(dòng)氨基酸分析系統(tǒng)對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。將水解產(chǎn)物過(guò)濾濃縮到10 mL，測(cè)其中游離谷氨酸含量，即可認(rèn)為是γ-PGA的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株C1的生長(zhǎng)曲線

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，因?yàn)榇穗A段菌體繁殖較旺盛，可以提高誘變效率，同時(shí)保證誘變處理時(shí)具有一定的細(xì)胞濃度以增加變異細(xì)胞總數(shù)。菌株C1生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可知，菌株C1在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～20 h時(shí)，OD600迅速增大，表明菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)活躍，DNA復(fù)制旺盛，因此選用12 h的菌體制備菌懸液進(jìn)行誘變處理。

圖1 C1菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of strain C1

2.2 菌株C1紫外誘變存活曲線

圖2為菌株C1紫外誘變存活曲線。由圖2可以看出：紫外線對(duì)C1的致死率很高，在紫外照射60 s后，C1的致死率幾乎達(dá)到100%。一般認(rèn)為致死率在80%～90%左右，即存活率為10%～20%左右的誘變處理下，可保證菌體獲得最大程度的正突變，因此選擇紫外照射時(shí)間20、30和40 s為復(fù)合誘變的誘變劑量。

圖2 菌株C1紫外線照射存活率曲線Fig.2 Survival rate curve of C1 by ultraviolet light

2.3 菌株C1亞硝基胍誘變存活曲線

NTG是烷化劑類(lèi)誘變劑，在合適的條件下，它導(dǎo)致細(xì)胞死亡率低而誘變突變率高，對(duì)細(xì)胞具有誘發(fā)1次至多次突變的效力，有超級(jí)誘變劑之稱(chēng)。圖3為菌株C1亞硝基胍誘變存活曲線。由圖3可知：當(dāng)NTG質(zhì)量濃度大于0.2 mg/mL時(shí)，C1的致死率超過(guò)了97%；當(dāng)NTG質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，致死率為100%。所以選擇0.1、0.15和0.2 mg/mL NTG為復(fù)合誘變的誘變劑量。

圖3 C1菌株NTG存活率曲線Fig.3 Survival rate curve of C1 by NTG induce

2.4 菌株C1復(fù)合誘變后γ-PGA產(chǎn)量

經(jīng)復(fù)合誘變處理后，共從平板上挑選黏度較大的菌株180株，分別對(duì)這些菌株進(jìn)行液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其發(fā)酵液黏度，并以出發(fā)菌株的發(fā)酵液黏度為標(biāo)準(zhǔn)，從中篩選出9株黏度較大的菌株C1-1、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8和C1-9，分別測(cè)定其γ-PGA產(chǎn)量，進(jìn)行下一步篩選，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 C1及其各突變株生產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量Fig.4 Yield of γ-PGA produced by C1 and its mutant

由圖4可知：與出發(fā)菌株C1相比，C1-6和C1-9這2株突變株γ-PGA發(fā)酵產(chǎn)量明顯提高，分別達(dá)到24.2和23.1 g/L，產(chǎn)量分別提高31.5%和25.5%，因此選擇這2株菌進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：雖然C1-6和C1-9的γ-PGA發(fā)酵產(chǎn)量獲得提高，但是其遺傳穩(wěn)定性不同。C1-6菌株在傳代8次后，產(chǎn)量仍然能保持在23.8 g/L的水平，而C1-9傳代8次后，產(chǎn)量下降到17.2 g/L，說(shuō)明C1-6突變后的遺傳穩(wěn)定性較高，因此選擇C1-6突變株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

在微生物誘變育種中，利用復(fù)合因素來(lái)擴(kuò)大誘變幅度，可以提高誘變效果。梁金忠等［13］采用紫外誘變技術(shù)對(duì)Bacillus subtilis B-1進(jìn)行反復(fù)誘變，得到1株能夠利用玉米原料生產(chǎn)γ-PGA的優(yōu)良高產(chǎn)菌株B-115，搖瓶發(fā)酵γ-PGA的產(chǎn)量由原菌株的12.5 g/L提高到19.5 g/L。徐艷萍等［14］對(duì)Bacillus licheniformis進(jìn)行亞硝基胍和60Co誘變，獲得1株γ-PGA的高產(chǎn)菌株C9，γ-PGA產(chǎn)量由9.44 g/L提高到19.76 g/L，提高了109%。本研究中，筆者采用物理和化學(xué)2種因素（分別為紫外線和亞硝基胍）對(duì)出發(fā)菌株C1進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得了1株正突變菌株，且遺傳性能穩(wěn)定。

表2 突變株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Genetic stability of mutant C1-6 and C1-9

2.5 C源對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響

種子液培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、麥麩、谷氨酸和米糠作為C源，其他條件相同，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知：葡萄糖作為C源時(shí)，C1-6菌株生物量最大，但是在工業(yè)生產(chǎn)中，選用葡萄糖成本較高，因此選用玉米粉這種廉價(jià)的成分替代葡萄糖。當(dāng)玉米粉作為C1-6的C源時(shí)，其種子液OD600達(dá)到4.8。

圖5 C源對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of carbon sources on growth of C1-6

2.6 N源對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響

種子液培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、黃豆粉、尿素、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3和谷氨酸作為N源，其他條件相同，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：酵母膏作為N源時(shí)，C1-6種子液生物量最大，但是在工業(yè)生產(chǎn)中，選用酵母膏成本較高，因此選用黃豆粉替代酵母膏。當(dāng)黃豆粉作為C1-6的N源時(shí)，其種子液OD600達(dá)到4.5。

2.7 無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響

無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株C1-6生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知：低濃度的K2HPO4（＜1 g/L）和MgSO4（＜0.5 g/L）對(duì)C1-6的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而MnSO4在低濃度條件下對(duì)C1-6的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用。

圖6 N源對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of nitrogen sources on growth of C1-6

2.8 培養(yǎng)基初始pH對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響

考察培養(yǎng)基的初始pH（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0）對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知：初始pH對(duì)C1-6生長(zhǎng)有著顯著的影響，當(dāng)初始pH為6.5時(shí)，對(duì)C1-6生長(zhǎng)最為有利。

2.9 溫度對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響

將C1-6分別置于30、33、37、40和45℃下170 r/min培養(yǎng)24 h，考察不同溫度對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，C1-6最適生長(zhǎng)溫度為37℃。

2.10 裝液量對(duì)C1-6生長(zhǎng)的影響

在150 mL三角瓶中分別加入20、30、40和50 mL培養(yǎng)基，考察不同裝液量對(duì)C1-6種子液生物量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知：裝液量為20 mL（1/ 7.5）和30 mL（1/5）條件下C1-6種子液生物量較大，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的效率，選用30 mL裝液量。

圖7 無(wú)機(jī)鹽（K2HPO4、MgSO4和MnSO4）對(duì)C1-6突變株生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of inorganic salts（K2HPO4，MgSO4，and MnSO4）on growth of mutant C1-6

圖8 培養(yǎng)基起始pH對(duì)C1-6突變株生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of initial pH on growth of mutant C1-6

2.11 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化種子液培養(yǎng)基配方

綜合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇 K2HPO4、MgSO4、黃豆粉和玉米粉為因素，以 C1生物量（OD600）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)。因素水平表和正交試驗(yàn)結(jié)果如表3和表4所示。發(fā)酵條件為培養(yǎng)基pH 6.5、培養(yǎng)溫度37℃和裝液量30 mL（1/5）。結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)C1種子液生物量影響的主次順序?yàn)辄S豆粉、MgSO4、K2HPO4、玉米粉，且發(fā)酵的最佳工藝條件為 K2HPO41.0 g/L、MgSO40.5 g/L、黃豆粉15.0 g/L和玉米粉5.0 g/L。

圖9 培養(yǎng)溫度對(duì)C1-6突變株生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effects of culture temperature on growth of mutant C1-6

圖10 裝液量對(duì)C1-6突變株生長(zhǎng)的影響Fig.10 Effects of culture volume on growth of mutant C1-6

表3 正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果Table 3 Results and factors and lever of orthogonal experiment

表4 誤差分析Table 4 Error analysis

工業(yè)生產(chǎn)中還需要降低生產(chǎn)成本，故本研究對(duì)突變株C1-6的種子液發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為其篩選了廉價(jià)的C源（玉米粉）和N源（黃豆粉）。玉米中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68%以上的成分是淀粉［15］，因此，利用玉米原料供應(yīng)微生物生長(zhǎng)需要有效地開(kāi)發(fā)和利用玉米中的淀粉。黃豆粉也是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)原料，其中含有大量的不飽和脂肪酸，并含有鈣、鐵、鋅、磷、鎂、維生素B等營(yíng)養(yǎng)成分，是能夠被微生物利用的N源。因此，選用玉米粉和黃豆粉為種子液原料，可大大降低生產(chǎn)成本。

除此以外，還可以通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和改進(jìn)發(fā)酵工藝等方法提高微生物的發(fā)酵產(chǎn)量?；菝鞯龋?6］發(fā)現(xiàn)檸檬酸、甘油和（NH4）2SO4是 Bacillus sp.B53合成γ-PGA比較適宜的C源和N源，在優(yōu)化培養(yǎng)基上產(chǎn)生γ-PGA 19.12 g/L，比原始基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上的 8.87 g/L提高了 115.56%。Yoon等［17］利用分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)使得 Bacillus lichenifomis合成γ-PGA的能力達(dá)到35 g/L。因此，可以在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)C1-6突變株的液體發(fā)酵的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更高的γ-PGA產(chǎn)量。

3 結(jié)論

以已篩選的1株產(chǎn)γ-PGA的解淀粉芽胞桿菌C1為出發(fā)菌株，通過(guò)復(fù)合誘變選育到1株能夠穩(wěn)定遺傳的正突變菌株C1-6，其搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量為24.2 g/L，且傳代8次后仍能保持穩(wěn)定。同時(shí)對(duì)C1-6的種子液發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可知，C1-6在成分為K2HPO41.0 g/L、MgSO40.5 g/L、黃豆粉15.0 g/L、玉米粉5.0 g/L，pH 6.5的培養(yǎng)基中，37℃、裝液量30 mL的培養(yǎng)條件下可獲得較大的生物量。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Breeding high γ-polyglutamic acid-producing strain by composite mutation and the optimization of its seeds culture

ZHANG Rui1，ZHOU Jun1，2，WANG Shuya1，2，SHEN Lizhen1，CHEN Yilu1，ZHENG Tao1，2，YONG Xiaoyu1，2
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.Bioenergy Research Institute，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

Bacillus amyloliquefaciens C1，isolated by our laboratory as a γ-polyglutamic acid producer，was treated with composite mutation method of ultraviolet and nitrosoguanidine.The liquid seed medium was also optimized by single-factor and orthogonal experiments.The resulted mutant strain C1-6 was screened with a γ-polyglutamic acid productivity of 24.2 g/L，increased by 31.5%compared with the original strain C1.C1-6 had a good genetic stability after 8 generations by transfer of culture experiment.Corn flour and soybean cake were selected as the carbon and nitrogen source respectively for C1-6 through single-factor experiments.Finally，the results of orthogonal experiments showed that the optimized liquid seed medium component was K2HPO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，soybean cake 15.0 g/L and corn flour 5.0 g/L.In 150 mL shake flask，the optimal temperature，original pH and medium volume were 37℃，pH 6.5 and 30 mL，respectively，the larger biomass is obtained，the OD600is 6.31.

composite mutation；γ-polyglutamic acid；seeds culture；orthogonal experiment；optimization

TQ922

A

1672-3678（2015）01-0047-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.009

2013-09-22

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2013CB733904、2013CB7335002、2011CBA00807）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA023406）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20130932）；江蘇省高校自然科學(xué)基金（13KJB530009）

張 瑞（1990—），女，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：微生物與分子生物學(xué)；雍曉雨（聯(lián)系人），講師，E-mail：yongxiaoyu@ njtech.edu.cn