李士林，王宜君，湯朝起，許贛榮

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082）

耐高溫菌的分離及在固態(tài)發(fā)酵上部煙葉中的應(yīng)用

李士林1，王宜君1，湯朝起2，許贛榮1

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082）

從上部低次煙葉中篩選出耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌GW-2和耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌GW-3，通過對(duì)菌落的形態(tài)觀察、16S rRNA的鑒定和同源性分析，初步確定GW-2為解淀粉芽胞桿菌，GW-3為枯草芽胞桿菌。對(duì)上部低次煙葉進(jìn)行雙菌種固態(tài)發(fā)酵，并優(yōu)化發(fā)酵條件，最佳發(fā)酵條件：GW-2菌懸液（OD600=1）接種量為7.5 mL/g，GW-3菌懸液（OD600=1）接種量為10 mL/g，物料填充度為500 mL三角瓶中裝50 g煙葉干基，當(dāng)煙葉發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，48℃發(fā)酵5 d。在該發(fā)酵條件下，上部低次煙葉的淀粉降解率為22.33%，蛋白質(zhì)降解率為16.74%。煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大幅度下降，其含量指標(biāo)接近優(yōu)等煙葉的含量。該發(fā)酵方式比傳統(tǒng)的貯存式煙葉發(fā)酵大大縮短了發(fā)酵時(shí)間。

上部低次煙葉；耐高溫有益菌；固態(tài)發(fā)酵；淀粉；蛋白質(zhì)

國內(nèi)優(yōu)等煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在4%和7%左右［1］，而本實(shí)驗(yàn)所涉及的上部低次煙葉中的淀粉、蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7%以上和10%以上，較優(yōu)等煙葉明顯偏高，致使吸食后香氣欠缺、較苦、刺激性大，目前只用于低檔卷煙的配方中，或者直接丟棄，嚴(yán)重影響了卷煙行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益［2-4］。如果能降低上部低次煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的含量，可有效減少煙葉在吸食過程中產(chǎn)生的辛辣味和刺激性，提高煙葉的利用價(jià)值，減少資源的浪費(fèi)［5］。

煙葉表面定殖大量微生物，這些微生物在煙葉的貯存過程中對(duì)于改進(jìn)煙葉品質(zhì)發(fā)揮一定的作用。目前，利用人工接種微生物對(duì)煙葉進(jìn)行發(fā)酵的研究也有不少報(bào)道，但是大多數(shù)研究均局限于低水分（發(fā)酵水分低于 20%）下的貯存式發(fā)酵［6-7］。在固態(tài)低水分狀態(tài)下，微生物的生長代謝速度一般較為緩慢，因此會(huì)影響煙葉發(fā)酵陳化的速度。而煙葉在高水分發(fā)酵時(shí)，雖然可以加快發(fā)酵速度，但是也極易引起霉菌的生長。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煙葉發(fā)酵溫度超過48℃時(shí)，未發(fā)現(xiàn)煙葉發(fā)霉現(xiàn)象。所以采用高溫、高水分發(fā)酵的方法值得探索。從煙葉中篩選產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的耐高溫微生物，并將其應(yīng)用于煙葉的固態(tài)發(fā)酵，有可能加速并有效地降解低次煙葉中的淀粉和蛋白質(zhì)，從而提高煙葉的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

上部低次煙葉（2012年福建煙葉），由上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供；H2-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV 3000型紫外-可見分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；FA 1004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PL602-S型電子天平，METTLER TOLEDO儀器上海儀器有限公司；PB-10型pH計(jì)，SartoriUs公司；Sartorius MA-40型紅外線水分測(cè)試儀，德國賽多利斯公司；PYX-XHS-405型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

富集培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0， NaCl 5.0；pH 7.0～7.2。

種子液培養(yǎng)基：同富集培養(yǎng)基。

肉湯瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，瓊脂20.0，NaCl 5.0；pH 7.0～7.2。

斜面保藏培養(yǎng)基：同肉湯瓊脂培養(yǎng)基。

淀粉液態(tài)培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，可溶性淀粉20.0；pH 7.0～7.2。

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，可溶性淀粉20.0，酵母膏5.0，瓊脂20.0；pH 7.0～7.2。

奶粉液態(tài)培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水900 mL。脫脂奶粉10 g，溶于100 mL去離子水中，121℃滅菌20 min。將二者在無菌環(huán)境下混勻。

奶粉瓊脂培養(yǎng)基：于奶粉液態(tài)培養(yǎng)基中加20 g/L的瓊脂。

以上培養(yǎng)基都調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，于121℃滅菌20 min。

豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽200 g，蒸餾水1 L，煮沸15 min，用紗布過濾，加葡萄糖20.0 g，酵母膏0.5 g，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌和蛋白酶產(chǎn)生菌的分離篩選

耐高溫菌的篩選 取粉碎后的煙葉末1.0 g，裝入盛有100 mL富集培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，50℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液涂布到肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板中，于培養(yǎng)箱50℃恒溫培養(yǎng)72 h，將生長出的細(xì)菌通過劃線法獲得單菌落后接入斜面保存。

初篩 將篩選出的單菌落分別點(diǎn)接種到淀粉培養(yǎng)基平板和奶粉培養(yǎng)基平板中，50℃培養(yǎng)24 h，篩選出的菌株接入斜面保藏。

篩選菌株發(fā)酵液酶活測(cè)定 將初篩得到的單菌落分別接種到含100 mL種子液培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，50℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后分別取2 mL菌液接種至100 mL淀粉液態(tài)培養(yǎng)基或奶粉液態(tài)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，50℃、200 r/min培養(yǎng)72 h；發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)酶活。

菌株的復(fù)篩 取50 g煙葉，分別噴灑單一菌株的菌懸液5 mL，補(bǔ)水至煙葉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，將煙葉裝入500 mL三角瓶中，50℃下發(fā)酵3 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)煙葉的淀粉和蛋白質(zhì)含量。分別篩選出淀粉和蛋白質(zhì)降解率最高的菌株，接入斜面保藏。

1.2.2 種子菌懸液的制備

用接種針將斜面上的菌種點(diǎn)接到含100 mL種子液培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后分別取2 mL種子液接種至含100 mL豆芽汁培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，4 000 r/min離心5 min，取菌體，加適量無菌水，配制成OD600=1的菌懸液，用于人工接種發(fā)酵。

1.2.3 雙菌種固態(tài)發(fā)酵方法

量取優(yōu)化后的菌株菌懸液3.75 mL、優(yōu)化后的菌種菌懸液10 mL均勻噴灑50 g煙葉（干基）中，補(bǔ)水使煙葉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%。將煙葉均勻裝入500 mL三角瓶中，于培養(yǎng)箱中48℃下發(fā)酵。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)酵液淀粉酶和蛋白酶酶活的測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［8］測(cè)定淀粉酶活性。溫度為50℃時(shí)，1 min催化分解淀粉生成1 mg麥芽糖所需酶量定義為1個(gè)酶活（U），對(duì)3個(gè)平行樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 蛋白酶酶活測(cè)定

采用Folin-酚試劑顯色法［9］測(cè)定蛋白酶活性。溫度為50℃時(shí)，1 min生成1 μg酪氨酸所需酶量定義為1個(gè)酶活（U），對(duì)3個(gè)平行樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 細(xì)菌的形態(tài)特征

將37℃培養(yǎng)48 h的平板進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，將37℃培養(yǎng)24 h的種子液進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)，參照文獻(xiàn)［10］。

1.3.4 16S rDNA序列分析

所用引物為細(xì)菌 16S rDNA的通用引物。16SF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16SR：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

擴(kuò)增（PCR）反應(yīng)體系（25 μL）為 dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，Mg2+（20 mmol/L）2 μL，引物（20 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA（約50 ng/μL）1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，補(bǔ)水至25 μL。

擴(kuò)增（PCR）程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火45 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.75%的瓊脂糖凝膠電泳回收，純化后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后獲得的16S rDNA序列登錄http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi網(wǎng)站，用BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)分析，應(yīng)用ClustalX、Mega4軟件，采用Neighbor-Joining法（鄰接法）建立進(jìn)化樹狀圖。

1.3.5 煙葉化學(xué)成分的測(cè)定

煙葉水分的測(cè)定采用紅外快速水分測(cè)定儀測(cè)定；煙葉水溶性總糖及淀粉的測(cè)定參照文獻(xiàn)［11］；總氮、蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法；煙堿含量采用紫外分光光度法。淀粉和蛋白質(zhì)的降解率的計(jì)算見式（1）和式（2）。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌的初篩結(jié)果

經(jīng)50℃平板培養(yǎng)，初篩獲得5株耐高溫細(xì)菌（編號(hào)為GW-1～GW-5）。利用淀粉瓊脂培養(yǎng)基對(duì)這5株菌進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)其中4株菌GW-1、GW-2、GW-4和GW-5具有淀粉降解能力，GW-3沒有淀粉降解能力。所測(cè)得的淀粉水解透明圈與發(fā)酵液淀粉酶活力如表1所示。

表1 4株菌的淀粉水解透明圈及發(fā)酵液淀粉酶活力Table 1 Starch hydrolysis halos and amylase activities of 4 strains

由表1比較不同菌種在平板上的透明圈直徑/菌落直徑值以及發(fā)酵液淀粉酶活力發(fā)現(xiàn)，GW-5的透明圈直徑/菌落直徑比值最大，GW-2的發(fā)酵液淀粉酶活力最高。鑒于鑒定培養(yǎng)基與煙草發(fā)酵基質(zhì)成分上存在差異性，本研究進(jìn)一步將4株菌接種至煙葉發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)考察煙葉中淀粉的降解情況，對(duì)照組為不接種煙葉，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同菌株發(fā)酵后煙葉淀粉降解率的比較Fig.1 Comparison of starch decomposition rates of tobacco leaf after fermentation

由圖1可見：4株淀粉酶產(chǎn)生菌均對(duì)煙葉中的淀粉有不同程度的降解，其中GW-2菌株的淀粉降解率最高，故選擇GW-2為最佳發(fā)酵菌株。

2.2 耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選

利用奶粉瓊脂培養(yǎng)基對(duì)5株菌進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)GW-1、GW-2、GW-3、GW-4和GW-5具有蛋白質(zhì)降解能力。所測(cè)得的蛋白質(zhì)水解透明圈與發(fā)酵液淀粉酶活力如表2所示。

表2 5株菌的蛋白質(zhì)水解透明圈及發(fā)酵液蛋白酶活力Table 2 Protein hydrolysis halos and protease activities of 5 strains

由表2比較不同菌種在平板上的透明圈直徑/菌落直徑比值以及發(fā)酵液蛋白酶活力發(fā)現(xiàn)，GW-3的透明圈直徑/菌落直徑比值最大，GW-4的發(fā)酵液蛋白酶活力最高。鑒于鑒定培養(yǎng)基與煙草發(fā)酵基質(zhì)成分上存在差異性，本研究進(jìn)一步將5株菌接種至煙葉發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)考察煙葉中淀粉的降解情況，對(duì)照組為不接種煙葉，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同菌株發(fā)酵后煙葉蛋白質(zhì)降解率的比較Fig.2 Comparison of protein decomposition rates of tobacco leaf after fermentation

由圖2可見：發(fā)酵結(jié)束后，5種菌對(duì)煙葉蛋白質(zhì)都有不同程度的降解，GW-2菌株雖然有蛋白酶酶活性，但是在發(fā)酵過程中煙葉蛋白質(zhì)降解率與對(duì)照組相差不大，說明此菌株在煙葉發(fā)酵中沒有表現(xiàn)出蛋白酶酶活性。GW-3的淀粉降解率最高，故選擇GW-3為最佳發(fā)酵菌株。

2.3 GW-2與GW-3的形態(tài)觀察

經(jīng)平板培養(yǎng)48 h后觀察，GW-2菌落呈花瓣形狀，淡黃色不透明，菌落中間呈脈狀；GW-3菌落呈淡黃色不透明，邊緣不整齊，中間凸起。經(jīng)液態(tài)培養(yǎng)24 h后顯微鏡觀察，GW-2菌株呈短桿狀，GW-3菌株呈球狀或橢圓狀，經(jīng)革蘭氏染色后，兩株菌均呈陽性。

2.4 GW-2與GW-3的16S rRNA序列分析

GW-2菌株的16S rRNA序列全長為1 413 bp，用BLAST進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明GW-2與解淀粉芽胞桿菌的同源性為100%，初步確定GW-2菌株為解淀粉芽胞桿菌。菌株GW-3菌株的16S rRNA序列全長1 404 bp，用BLAST進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明GW-3與枯草芽胞桿菌的同源性為100%，初步確定GW-3菌株為枯草芽胞桿菌，經(jīng)比對(duì)構(gòu)建樹狀圖，如圖3所示。

2.5 雙菌種固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉發(fā)酵條件的確定

2.5.1 GW-3菌株菌懸液接種量的確定

由于上部低次煙葉蛋白質(zhì)含量過高，從而導(dǎo)致煙葉辛辣味，所以降低蛋白質(zhì)的含量是首要目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，筆者設(shè)計(jì)GW-3菌株菌懸液接種量為2.5～15（mL/g），發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得煙葉蛋白質(zhì)降解率，如圖4所示。

圖3 GW-2和GW-3的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic trees of 16S rDNA of GW-2 and GW-3 strain

圖4 GW-3接種量對(duì)煙葉蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.4 Effects of inoculum of GW-3′s bacterial suspension on decomposition rate of protein in tobacco

由圖4可見：蛋白質(zhì)的降解率隨著GW-3菌懸液用量的增加而升高，當(dāng)接種量為10 mL/g時(shí)，蛋白質(zhì)降解率達(dá)到最大值，之后隨著接種量的增加，蛋白質(zhì)降解率基本不變。

2.5.2 GW-2菌懸液接種量的確定

設(shè)計(jì)GW-3接種量為10 mL/g，GW-2接種量為2.5～12.5 mL/g，發(fā)酵結(jié)束后煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率如圖5所示。

由圖5可見：當(dāng)GW-2接種量達(dá)到7.5 mL/g時(shí)，蛋白質(zhì)的降解率開始有所下降，這可能是GW-2生物量過多，影響了 GW-3的代謝。故選擇GW-2的接種量為7.5 mL/g。

2.5.3 物料填充度的影響

固態(tài)發(fā)酵時(shí)，煙葉物料填充度的大小會(huì)影響O2的傳遞，進(jìn)而影響微生物的生長。設(shè)計(jì)物料填充度范圍為每500 mL三角瓶中30～80 g煙葉干基，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率，如圖6所示。

圖5 GW-2接種量對(duì)煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.5 Effects of inoculum of GW-2′s bacterial suspension on decomposition rate of starch and protein in tobacco

圖6 物料填充度對(duì)煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.6 Effects of filling degree on decomposition rate of starch and protein in tobacco

由圖6可見：填充度為30～50 g煙葉干基時(shí)，淀粉和蛋白質(zhì)的降解率維持較高且基本不變；當(dāng)填充度超過50 g煙葉干基時(shí)，淀粉和蛋白質(zhì)的降解率會(huì)隨著填充度的增大而降低。為了節(jié)省空間，最佳物料填充度確定為每500 mL三角瓶中填充50 g煙葉干基。

2.5.4 發(fā)酵溫度的影響

當(dāng)發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)30%以上時(shí)，發(fā)酵溫度只有到達(dá)48℃以上時(shí)霉菌才不能生長，而發(fā)酵溫度過高會(huì)使煙葉變黑，故設(shè)置本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵溫度為48、50、52、54和56℃，煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率結(jié)果如圖7所示。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.7 Effects of fermentation temperatures on decomposition rate of starch and protein in tobacco

由圖7可見：煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的降解率隨著發(fā)酵溫度的升高而下降，雖然2株菌都可以在48℃下生長，但溫度的升高也會(huì)抑制菌體的生長活動(dòng)。所以本實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵溫度確定為48℃。

2.5.5 煙葉物料水分的影響

水分是影響固態(tài)發(fā)酵的重要條件，水分的高低影響著微生物的生長代謝活動(dòng)。研究不同發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)發(fā)酵后煙葉的淀粉和蛋白質(zhì)的降解率的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.8 Effects of tobacco leaf moisture content on decomposition rate of starch and protein in tobacco

由圖8可見：發(fā)酵結(jié)束后上部低次煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率隨著發(fā)酵水分的增加而逐漸提高。當(dāng)發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過45%時(shí)，淀粉和蛋白質(zhì)降解率變化趨緩。考慮到水分過高，發(fā)酵后煙葉的顏色變深，發(fā)酵水分宜低不宜高，故發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇45%。

2.5.6 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物生長及其代謝產(chǎn)物有重要的影響。在確定其他發(fā)酵條件下，設(shè)計(jì)不同的發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵結(jié)束后煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的降解率如圖9所示。

煙葉在高水分高溫度發(fā)酵過程中，煙葉的形狀和顏色隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而變化嚴(yán)重，因此應(yīng)該盡量縮短發(fā)酵時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵第5天時(shí)，淀粉和蛋白質(zhì)的降解率達(dá)到 22.33%和16.74%。淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至5.80%和8.49%，已經(jīng)達(dá)到優(yōu)等煙葉的含量要求，而且從圖9中還可看出，延長發(fā)酵時(shí)間，對(duì)提高煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的降解率沒有明顯的作用。故本實(shí)驗(yàn)決定發(fā)酵時(shí)間為5 d。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙葉淀粉和蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.9 Effects of fermentation time on decomposition rate of starch and protein in tobacco

2.5.7 發(fā)酵結(jié)束后上部低次煙葉化學(xué)成分變化

將2.5.6中發(fā)酵結(jié)束的煙葉進(jìn)行化學(xué)成分的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

由表3可見：發(fā)酵結(jié)束后的煙葉較原煙葉淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度降低，水溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有上升，總氮和煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降。煙堿的下降也會(huì)提高煙葉的利用價(jià)值。

施木刻值和糖氮比是衡量煙葉品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)等煙葉的施木刻值為2～2.5，糖氮比為（6～10）∶1［1］。發(fā)酵結(jié)束后的煙葉施木刻值更加接近2，糖氮比更加接近6，煙葉的化學(xué)成分變得更加協(xié)調(diào)，煙葉的品質(zhì)得到了明顯的改善。

表3 雙菌種發(fā)酵結(jié)束后煙葉的主要化學(xué)成分及其變化Table 3 Changes of chemical composition in tobacco after fermentation by two strains

3 結(jié)論

從上部低次煙葉中篩選出耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌GW-2和耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌GW-3，通過對(duì)2株菌菌落的形態(tài)觀察和16S rRNA的鑒定，初步鑒定為解淀粉芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌。利用2株菌對(duì)上部低次煙葉進(jìn)行雙菌種固態(tài)發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，上部低次煙葉雙菌種固態(tài)發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件：GW-2菌懸液（OD600=1）接種量為7.5 mL/g，GW-3菌懸液（OD600=1）接種量為10 mL/g，物料填充度為每500 mL三角瓶中添加50 g煙葉干基，發(fā)酵溫度為48℃，煙葉水分為45%，發(fā)酵時(shí)間為5 d。在該發(fā)酵條件下，上部低次煙葉的淀粉降解率為22.33%，蛋白質(zhì)降解率為16.74%。煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的含量得到了較大幅度的下降，基本達(dá)到了優(yōu)等煙葉的含量要求。

與傳統(tǒng)的煙葉自然陳化相比，筆者所采用的高水分雙菌種固態(tài)發(fā)酵方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于能短時(shí)間內(nèi)大幅度降解上部低次煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的含量，而且由于采用高溫發(fā)酵，基本上可杜絕霉菌的生長，避免煙葉發(fā)霉產(chǎn)生異味。但固態(tài)高溫發(fā)酵對(duì)煙葉香氣成分及吸味的影響還有待于進(jìn)一步考察。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Isolation and application of thermotolerant bacterials to solid-state
fermentation of upper-leaves of tobacoo

LI Shilin1，WANG Yijun1，TANG Zhaoqi2，XU Ganrong1
（1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Shanghai Tobacco Group Co.Ltd.，Shanghai 200082，China）

In this study，two thermotolerant strains were isolated from tobacoo leaves.One is an amylase producing bacterial strain named GW-2 and another is a protease producing bacterial strain named GW-3.By morphological observation of colonies and 16S rRNA sequence homology analysis，they were identified as Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens.Then the two strains were used for tobacco solid-state fermentation，and the condition was optimized by monofactorial experiments.The experimental results show that the best conditions for solid-state fermentation were that：inoculum of bacterial suspension（OD600=1）of GW-2 and GW-3 were 7.5 mL/g and 10 mL/g，respectively，charge amount of tobacoo was 50 g（500 mL flask），fermentation temperature was 48℃，moisture content of the tobacco was 45%and fermentation time was 5 d.Under these conditions of solid-state fermentation，the starch and protein decomposition rates in the upper leaves of flue-cured tobacco were 22.33%and 16.74%，respectively.The content of starch and protein in the upper leaves of flue-cured tobacco was close to the standard of the top quality tobacco.In this way，the fermentation time was greatly shortened than traditional storage fermentation.

upper leaves of flue-cured tobacco；thermotolerant bacterials；solid-state fermentation；starch；protein

Q93

A

1672-3678（2015）01-0035-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.007

2013-12-13

上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（SZBCW201000744）

李士林（1987—），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工學(xué)；許贛榮（聯(lián)系人），教授，E-mail：grxu123@126.com