邢亞梅，陳 勇，應漢杰

（南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院 國家生化工程技術研究中心，江蘇 南京 211800）

黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的pH調(diào)控策略

邢亞梅，陳 勇，應漢杰

（南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院 國家生化工程技術研究中心，江蘇 南京 211800）

為了提高黑曲霉（Aspergillus niger）D08生產(chǎn)木聚糖酶的能力，考察了不同pH條件對菌株生長及產(chǎn)酶的影響，結果發(fā)現(xiàn)木聚糖酶發(fā)酵過程中菌體生長的最適pH與木聚糖酶合成的最適pH不同，分別為3.5和4.5。由此針對性地提出了兩階段pH控制策略：在30 h內(nèi)控制pH為3.5；30 h后pH控制為4.5。結果表明：分階段pH調(diào)控策略的實施進一步提高了菌體合成木聚糖酶的能力，木聚糖酶比酶活（2 223.38 U/mL）和生產(chǎn)強度（26.47 U/（mL·h））分別比恒定pH 4.5時提高了14.3%和30.6%。該工藝對提高木聚糖酶活力具有一定的指導意義，為后續(xù)研究和生產(chǎn)奠定了良好的基礎。

pH調(diào)控；木聚糖酶；黑曲霉

植物纖維是自然界中儲存量最大、最豐富，也是最廉價的一類可再生資源，其中半纖維素約占15%～30%［1］。作為半纖維素的主要組成成分，木聚糖廣泛分布于高等植物的細胞壁中，是自然界中存儲量僅次于纖維素的多糖［2］。木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚糖和木糖的水解酶類，主要由β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（EC3.2.1.8）和β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）組成，其功能分別是切斷木聚糖主鏈中的木糖苷鍵以及將寡聚糖進一步降解為單體木糖［3］。

同時，木聚糖酶作為一種工業(yè)酶制劑，在諸多領域具有廣泛應用。在植物性飼料中，添加木聚糖酶可以降解飼料中的抗營養(yǎng)因子非淀粉多糖（NSPS），從而提高禽畜對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率［4］。在食品行業(yè)，木聚糖酶可以將半纖維素含量較高的農(nóng)業(yè)廢棄物降解成為低聚木糖［5］。在生物能源轉化領域，木聚糖酶可與纖維素酶系協(xié)同作用，將植物纖維降解為戊糖和己糖，并以其作為發(fā)酵底物，進一步通過微生物生產(chǎn)乙醇［6-7］。在生物制漿漂白領域，木聚糖酶可以作為生物漂白助劑應用于造紙工業(yè)［8］。

目前，木聚糖酶主要依靠微生物發(fā)酵法獲得，現(xiàn)已知能夠合成木聚糖酶的微生物主要涉及真菌、鏈霉菌、細菌和酵母等［1］。曲霉屬菌株（Aspergillus sp.）是生產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)良菌株，成為國內(nèi)外木聚糖酶生產(chǎn)研究的重點［9］。為了提高曲霉屬產(chǎn)木聚糖酶的能力，我國科研工作者已在菌種選育［10-11］、發(fā)酵優(yōu)化［12-14］、酶學性質(zhì)［10，15］等方面開展了大量的研究工作。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，pH、溫度均是影響微生物合成木聚糖酶的重要因素。針對菌體生長和木聚糖酶合成的最適溫度不一致這一特性，Yuan等［16］提出了一種分階段的溫度調(diào)控策略，使木聚糖酶的生產(chǎn)強度得到提高。受上述研究的啟發(fā)，本文嘗試研究pH對木聚糖酶發(fā)酵過程不同階段的影響，并以此為基礎開發(fā)新的pH控制策略，旨在提高微生物合成木聚糖酶的能力。

本文著重考察pH對黑曲霉（Aspergillus niger）D08菌株生長及產(chǎn)木聚糖酶能力的影響，并結合發(fā)酵動力學參數(shù)分析，導向性地采用分階段pH調(diào)控策略，以初步實現(xiàn)木聚糖酶的高效生產(chǎn)，旨在提高微生物合成木聚糖酶的能力。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）D08，由南京工業(yè)大學國家生化工程技術研究中心實驗室誘變篩選并保藏。

1.2 主要試劑

山櫸木木聚糖、3，5-二硝基水楊酸（DNS）（Sigma公司），馬鈴薯、麩皮粉和玉米芯粉均購自南京近郊（麩皮粉和玉米芯粉粉碎后過0.177 mm篩使用），其他試劑為化學純或分析純試劑。

1.3 主要儀器

WFJ7200型可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；HVE-50型高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；PYX-DHS-40×50-BS型隔水式電熱恒溫箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；ZQZY-C型震蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；BIOQ-PH12高通量生物反應器，匯合堂生物工程設備（上海）有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基（g/L）：麩皮50、蔗糖10。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：麩皮40、玉米芯28.1、NaNO34.2、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、吐溫-80 0.5。

以上培養(yǎng)基在121℃、105Pa條件滅菌15 min，待用。

1.5 培養(yǎng)方法

1）菌種活化 將保藏菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

2）菌種培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子以3%（體積分數(shù)）的接種量接入12通道的1 L生物反應器中，裝液量為400 mL，攪拌轉速為200 r/min，通氣量為0.8 vvm（1個vvm表示每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值），溫度30℃，以NaOH（1 mol/L）和稀HCl（1 mol/L）調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH。

1.6 粗酶液的制備

發(fā)酵液用冷凍離心機5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，即粗酶液。

1.7 生物量的測定

過濾法收集發(fā)酵培養(yǎng)物中的菌絲球，洗滌數(shù)次后移至干燥箱中，80℃恒溫干燥24 h，稱質(zhì)量。

1.8 木聚糖酶活的測定

取適當稀釋的粗酶液50 μL，加入0.45 mL的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH 4.8）及 1 mL、1.2%（質(zhì)量分數(shù)）的木聚糖底物，在50℃條件下反應30 min。木糖生成量的測定參照文獻［17］進行。

酶活定義（U）：在50℃條件下反應30 min，每分鐘降解底物生成1 μmol木糖所需的酶量。

1.9 菌體比速率的計算

2 結果與討論

2.1 未控制pH條件下Aspergillus niger D08發(fā)酵合成木聚糖酶的特性

在1 L高通量生物反應器中考察初始pH為6.0時菌體的發(fā)酵特征，結果如圖1所示。

圖1 初始pH為6.0時Aspergillus niger D08在發(fā)酵過程中pH、木聚糖比酶酶活及菌體生長的變化情況Fig.1 Time course of pH，xylanase activity and biomassin fermentation of Aspergillus niger D08 at initial pH of 6.0

由圖1可知：菌體生長經(jīng)過短暫的延滯期后很快進入指數(shù)生長期，發(fā)酵至48 h菌體生長進入穩(wěn)定期。24 h內(nèi)菌株產(chǎn)木聚糖酶的能力較弱，24 h后迅速產(chǎn)酶，96 h時比酶活達到最大值（1 621.22 U/mL），隨后趨于穩(wěn)定。木聚糖酶活力的增長趨勢明顯滯后于菌體生長，這再一次證明了黑曲霉合成木聚糖酶的過程屬于部分生長耦聯(lián)型［18］。

隨后觀察菌株發(fā)酵過程中pH的變化情況，可發(fā)現(xiàn)pH呈現(xiàn)先降低，后升高的趨勢：在36 h內(nèi)，pH由6.0下降至2.2，而后隨著培養(yǎng)時間的延長，pH緩慢上升至4左右。這一現(xiàn)象可能是因為在發(fā)酵前期，菌體快速生長的過程中產(chǎn)生大量有機酸［16］，導致pH降低；隨著細胞生長逐漸進入穩(wěn)定期，代謝產(chǎn)物積累，代謝活動降低，菌體細胞呼吸作用減弱，使得發(fā)酵體系中pH上升。

pH影響培養(yǎng)基中部分營養(yǎng)物質(zhì)的解離狀態(tài)、菌株細胞膜的生理功能及細胞內(nèi)各種酶的活性［19］，進而影響微生物的生長和產(chǎn)物的合成。

2.2 不同pH條件下Aspergillus niger D08發(fā)酵合成木聚糖酶的特性

為了進一步了解pH對菌株生長及產(chǎn)酶能力的影響，考察不同pH條件下菌體的生長和產(chǎn)酶情況結果見圖2。

圖2 不同pH對Aspergillus niger D08生長及產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effects of different pH on the cell growth and xylanase production of Aspergillus niger D08

由圖2可知：pH的升高致使菌體生長及產(chǎn)物合成產(chǎn)生延遲現(xiàn)象；同時，隨著pH的升高，菌體的生長速率及生物量呈現(xiàn)下降趨勢，然而木聚糖酶的活性則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH為4.5時最高，在pH為5.0時最低。當pH為3.5，發(fā)酵48 h時生物量達到最大值（10.45 g/L），之后細胞生長進入穩(wěn)定期；木聚糖酶的合成滯后于菌體生長，在發(fā)酵至72 h時達到最大比酶活（1 487.36 U/mL）。當pH高于3.5，細胞生長緩慢，生物量下降，木聚糖酶比酶活達到最大值的時間相應向后推遲。pH 4.5條件下，木聚糖酶比酶活最高（1 945.46 U/mL）；但菌體生長緩慢，發(fā)酵96 h木聚糖酶酶活才達到最大值，相比pH 3.5條件下推遲了24 h。當pH升至5.0時，細胞生長緩慢，生物量下降，合成木聚糖酶的能力也下降。

由圖2分析可得，相對較高的pH更有利于菌體合成木聚糖酶，但是過高的pH又不利于菌體生長。為了進一步研究不同pH條件對菌體生長及合成木聚糖酶的影響，考察了不同pH條件下細胞比生長速率和木聚糖酶比合成速率的動力學過程曲線，結果見圖3、圖4。由圖3和圖4可知：pH 3.5時細胞最大比生長速率為0.22 h-1，菌體生長達到對數(shù)生長末期［20］（比生長速率小于0.02 h-1）僅用了30 h，相比pH 4.5時縮短了34 h。當pH由3.5升至4.5，菌體合成木聚糖酶的最高比速率逐漸增大，在pH 4.5時達到最大（6.90 U/（mg·h）），但其木聚糖酶的比合成速率達到峰值的時間相比pH 3.5條件下推遲了24 h。當pH升至5.0時，菌體比生長速率，木聚糖酶比合成速率均偏低。以上結果表明，當pH控制為3.5時最適合菌體生長，而pH控制為4.5時最適合木聚糖酶的合成。

圖3 pH對Aspergillus niger D08的比生長速率的影響Fig.3 Effects of pH on specific cell growth rate in Aspergillus niger D08

2.3 Aspergillus niger D08發(fā)酵合成木聚糖過程中分階段pH控制策略的確定及驗證

雖然pH對菌體的生長和產(chǎn)物的合成均有顯著影響，但菌體在生長階段和產(chǎn)酶階段的最適pH不同，pH 3.5最適合菌體生長，pH 4.5最適合木聚糖酶的合成，而在pH 4.5條件下菌體生長和產(chǎn)物合成均表現(xiàn)出明顯的延遲現(xiàn)象，木聚糖酶酶活達到最高值的時間過長。為了進一步提高木聚糖酶的生產(chǎn)水平，針對性提出兩階段pH控制策略：發(fā)酵0～30 h，控制pH為3.5，以縮短細胞生長延滯期并促進菌體生長；30 h至發(fā)酵結束控制pH為4.5，利于細胞合成木聚糖酶，從而提高木聚糖酶的活力和生產(chǎn)強度，結果見圖5。

圖4 pH對Aspergillus niger D08合成木聚糖酶的比合成速率的影響Fig.4 Effects of pH on specific xylanase formation rate in Aspergillus niger D08

圖5 分階段控制pH對Aspergillus niger D08產(chǎn)酶及生長的影響Fig.5 Effects of pH shift operation on xylanase production and cell growth of Aspergillus niger D08

由圖5可知：采用分階段pH調(diào)控策略，顯著提高了菌株合成木聚糖酶的能力。在兩階段pH調(diào)控模式下，在48 h時，菌體達到生物量最大值，比恒定pH 4.5模式下提前24 h；最終，木聚糖酶比酶活（2 223.38 U/mL）和生產(chǎn)強度（26.47 U/（mL·h））比恒定pH 4.5模式下分別提高了14.3%和30.6%（表1）。

表1 兩階段pH控制策略與恒定pH 4.5模式下發(fā)酵參數(shù)Table 1 Fermentation properties of xylanase fermention in constant pH 4.5 and in pH control strategy

3 結論

本文詳細分析了木聚糖酶發(fā)酵過程中pH對Aspergillus niger D08菌體生長及產(chǎn)木聚糖酶能力的影響，結果表明：菌體生長的最適pH與木聚糖酶合成的最適pH不同，分別為3.5和4.5。在此基礎上，為進一步提高木聚糖酶的生產(chǎn)效率，針對性地提出了兩階段pH調(diào)控策略：0～30 h控制pH為3.5，30 h后控制pH為4.5。通過該策略，木聚糖酶比酶活和生產(chǎn)強度比恒定pH 4.5模式下分別提高了14.3%和30.6%。

基于兩階段pH控制策略，Aspergillus niger D08合成木聚糖酶的能力顯著提高，為后續(xù)研究酶的分離純化、酶學性質(zhì)及酶分子的定向改造奠定了基礎，并有利于木聚糖酶的規(guī)?；a(chǎn)應用。

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（責任編輯 荀志金）

Two-stage pH control strategy for xylanase production by Aspergillus niger D08

XING Yamei，CHEN Yong，YING Hanjie
（National Engineering Technique Research Center for Biotechnology，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

In order to improve xylanase production of Aspergillus niger D08，effects of pH on cell growth and xylanase production were investigated.The optimum pH for cell growth was 3.5，while that for xylanase production was 4.5.Accordingly，a two-stage pH control strategy was as follows：pH was controlled at 3.5 for the first 30 h，and then raised to 4.5 for the remaining time.With this strategy，the maximal xylanase activity and productivity ofxylanase reached 2 223.38 U/mL and 26.47 U/（mL·h），respectively，which were 14.3%and 30.6%higher than those in the single pH（pH 4.5）controlled model.This pH control strategy offers a promising guideline for enhancing the production of xylanase by Aspergillus niger D08，thus making a good foundation to further research and production of xylanase.

pH control；xylanase；Aspergillus niger

Q815

A

1672-3678（2015）01-0023-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.005

2013-12-30

國家杰出青年基金（21025625）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA021203）；國家科技支撐計劃（2012BAI44G01）；國家自然科學基金面上基金（21376118）；國家自然科學基金青年基金（21106070）；長江學者和創(chuàng)新發(fā)展計劃（PCSIRT）；江蘇自然科學基金（SBK20150207）；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目（PAPD）

邢亞梅（1988—），女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：生物催化；陳 勇（聯(lián)系人），副研究員，E-mail：chenyong1982@ njtech.edu.cn