付珍珍，李 恒，李 會(huì)，許正宏

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

Gibberella intermedia CA3-1羥基化去氫表雄酮的工藝

付珍珍1，李 恒2，李 會(huì)2，許正宏2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

利用Gibberella intermedia CA3-1對甾體化合物去氫表雄酮（DHEA）進(jìn)行C7α-羥基化反應(yīng)研究。用單因素實(shí)驗(yàn)的方法考察接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、有機(jī)溶劑助溶、投料濃度以及底物投加時(shí)間對產(chǎn)物7α-羥基去氫表雄酮（7α-OH-DHEA）生成的影響。最終確定最適工藝條件：接種量6%，裝液量30 mL（250 mL三角瓶），轉(zhuǎn)速220 r/min，體積分?jǐn)?shù)6%丙二醇助溶，接種時(shí)即添加底物，底物DHEA質(zhì)量濃度1 g/L，轉(zhuǎn)化時(shí)間36 h。采用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件，7α-OH-DHEA摩爾得率為72.34%。

生物轉(zhuǎn)化；7α-羥基化；去氫表雄酮；甾體；Gibberella intermedia

自開展甾體化合物研究以來，甾體藥物在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍便不斷擴(kuò)大，被用于治療多種疾?。?］。其中，甾體化合物去氫表雄酮（DHEA）及其羥化物被證實(shí)具有重要的生理活性和藥理作用，是甾體藥物研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。國外研究報(bào)道，DHEA及其代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DHEA的7α-羥基衍生物7α-OHDHEA具有抗氧化、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等重要的藥理作用［3］。7-羥基甾體化合物已經(jīng)被證實(shí)對治療癌癥和阿爾茨海默病有一定療效，此外它還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗糖皮質(zhì)激素作用和促進(jìn)減肥的功效［4］。

微生物對甾體底物的羥基化反應(yīng)是利用微生物代謝過程中的某一種酶或一組酶對外源性化合物進(jìn)行催化反應(yīng)［5］，具有立體選擇性、區(qū)域選擇性、反應(yīng)條件溫和、催化效率高、反應(yīng)類型多、污染環(huán)境小等特點(diǎn)，在甾體的生物轉(zhuǎn)化中具有重要的地位和意義［6-7］。DHEA用Fusarium moniliforme和Mortierella isabellina AM212進(jìn)行生物羥化的產(chǎn)物是7α-OHDHEA和7β-OH-DHEA［8］。Romano等［9］也研究證實(shí)Colletotrichum lini可以同時(shí)使DHEA發(fā)生7α-和15α-羥基化。根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)，DHEA最大投料質(zhì)量濃度為1 g/L，7α-OH-DHEA的最高收率為60.2%，且轉(zhuǎn)化周期為4 d［10］。篩選具有羥化DHEA生成7α-OH-DHEA的菌株，并且提高其底物添加濃度和轉(zhuǎn)化效率有重要的意義。

赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1是筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選得到的具有羥化DHEA生成7α-OH-DHEA的菌株，但目前該菌株轉(zhuǎn)化能力仍然偏低。文中筆者對Gibberella intermedia CA3-1羥化DHEA生成7α-OHDHEA的條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高產(chǎn)物得率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1由筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員篩選得到，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為CGMCC No.4903。

1.1.2 試劑

DHEA、7α-OH-DHEA均為分析純，由浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司提供；二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、丙三醇、甲醇、丙二醇、丙酮，均為化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑蘇州有限公司；乙腈，色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑蘇州有限公司；其他試劑為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖5、酵母粉10、NaCl 5、KH2PO415、瓊脂20，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖5、酵母粉10、NaCl 5、KH2PO415，pH 7.0。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15、酵母粉15、玉米漿2.0、NaCl 5，pH 6.5。

1.2 培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

在500 mL三角瓶中加入50 mL培養(yǎng)液，121℃滅菌20 min，然后將活化后的菌種接入三角瓶，在30℃、220 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌體培養(yǎng)

在250 mL三角瓶中裝入30 mL培養(yǎng)液，121℃滅菌20 min，將種子液以體積分?jǐn)?shù)為4%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。

1.2.3 生物轉(zhuǎn)化

準(zhǔn)確稱取一定量的DHEA加入到已培養(yǎng)24 h的菌液中，或者將底物溶于不同的有機(jī)溶劑中，超聲5 min以加速底物的溶解，然后加入到已培養(yǎng)24 h的菌液中，在30℃、220 r/min的恒溫?fù)u床上轉(zhuǎn)化培養(yǎng)48 h，每隔一定時(shí)間取樣檢測轉(zhuǎn)化效果。

1.3 分析方法

1.3.1 質(zhì)譜分析

電離源電噴霧電離（ESI）；毛細(xì)管電壓2.80 kV；錐空電壓40 V；源溫度110℃；脫溶劑溫度350℃。

1.3.2 高效液相色譜法［11］

取一定量發(fā)酵液，用等體積乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液并烘干。用5倍體積的乙腈復(fù)溶，0.25 μm有機(jī)濾膜過濾，采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行測定。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。測定條件：C18柱，流動(dòng)相 V（乙腈）∶V（水）=70∶30；流速為 0.5 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30℃。

1.3.3 計(jì)算方法

式中：ρ（產(chǎn)物）為液相測得的產(chǎn)物質(zhì)量濃度（g/L）；ρ（底物）為投加的底物質(zhì)量濃度（g/L）；M（底物）與M（產(chǎn)物）分別為底物與產(chǎn)物的摩爾質(zhì)量（g/mol）。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

2.1.1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜分析

赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1對DHEA的轉(zhuǎn)化液高效液相檢測結(jié)果如圖1所示?；衔?為底物，1和2分別為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。圖2為產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相檢測結(jié)果。由圖1和圖2可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2的保留時(shí)間一致，可以初步確定產(chǎn)物2為7α-OH-DHEA。

2.1.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物質(zhì)譜分析

赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1對DHEA的轉(zhuǎn)化液質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖3所示。通過分析可得到結(jié)果：MS（ESI）m/z［2M+NH4］+626.3、［3M+NH4］+930.6。結(jié)果表明樣品的相對分子質(zhì)量為304.2，與7α-OH-DHEA（C19H28O3）的相對分子質(zhì)量一致。

加工食物吃太多：加工食物含有大量的添加劑，這些添加劑中的化學(xué)成分都需要依靠肝臟解毒代謝。如果長期攝入加工食物，無形中增加肝臟負(fù)擔(dān)，容易引發(fā)慢性肝損傷。

圖1 Gibberella intermedia CA3-1轉(zhuǎn)化DHEA的產(chǎn)物高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of transformation products of DHEA by Gibberella intermedia CA3-1

圖2 7α-OH-DHEA標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of 7α-OH-DHEA standard

圖3 Gibberella intermedia CA3-1轉(zhuǎn)化DHEA產(chǎn)物的質(zhì)譜Fig.3 MS of transformation products of DHEA by Gibberella intermedia CA3-1

2.2 接種量對轉(zhuǎn)化的影響

選擇不同接種量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究其對轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：DHEA質(zhì)量濃度為 3 g/L、接種量為 6%時(shí)，產(chǎn)物 7α-OHDHEA得率最高，為28.35%。在發(fā)酵過程中，接種量過大，生物量過大造成菌液黏稠，對轉(zhuǎn)化過程溶氧不利；接種量過小，菌體生長過慢，同樣不利于轉(zhuǎn)化［12］，故最佳接種量為6%。

圖4 接種量對生物量及產(chǎn)物得率的影響Fig.4 Effects of inoculation amount on biomass of bacteria and product yield

2.3 裝液量和轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化的影響

圖5和圖6是裝液量和轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化的影響。由圖5和圖6可知，裝液量和轉(zhuǎn)速對7α-OH-DHEA的得率影響很大。250 mL三角瓶中裝液量為30 mL時(shí)，產(chǎn)物得率最大。甾體羥化是一個(gè)耗氧過程［13］，裝液量較多，溶氧下降，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效果不佳。在一定范圍內(nèi)，增加搖瓶轉(zhuǎn)速，溶氧水平相應(yīng)增加，可提高產(chǎn)物得率。在220 r/min時(shí)，產(chǎn)物得率較高，達(dá)到30.22%，但繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，得率反而下降。轉(zhuǎn)速過大，菌體受到較強(qiáng)的剪切作用，不利于菌體的生長，生物量下降。所以，裝液量選擇為30 mL，轉(zhuǎn)速為220 r/min較佳。

圖5 裝液量對生物量及產(chǎn)物得率的影響Fig.5 Effects of liquid volume in flask on biomass of bacteria and product yield

2.4 底物助溶劑種類及添加量

2.4.1 底物助溶劑種類

甾體化合物DHEA在水中的溶解度很低［14］，屬于微溶或難溶化合物，而甾體羥化酶屬于胞內(nèi)酶，底物只有通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞才能與酶接觸，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，這就限制了底物和胞內(nèi)羥化酶的有效接觸和反應(yīng)。甾體底物的難溶性對生物羥化反應(yīng)的速率和產(chǎn)物得率有重要的影響，是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率偏低的重要原因之一。目前，在甾體生物轉(zhuǎn)化中常用添加助溶劑的方法提高底物在水相的濃度。本研究中筆者以有機(jī)溶劑對底物的溶解性以及其對菌體的毒性為依據(jù)，選擇7種常用的有機(jī)助溶劑，包括DMSO、DMF、乙醇、丙三醇、甲醇、丙二醇和丙酮來提高底物DHEA在轉(zhuǎn)化液中的濃度和分散度，助溶劑對7α-OH-DHEA得率影響如圖7所示。由圖7可見：與對照相比，在菌液中加入體積分?jǐn)?shù)4%的助溶劑丙二醇后，產(chǎn)物得率有明顯提高，故選擇丙二醇作為最佳助溶劑。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對生物量及產(chǎn)物得率的影響Fig.6 Effects of rotation speed on biomass of bacteria and product yield

圖7 不同有機(jī)助溶劑對產(chǎn)物得率的影響Fig.7 Effects of different organic solvents on product yield

助溶劑的加入量控制至關(guān)重要，考察丙二醇的添加濃度對7α-OH-DHEA得率的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：丙二醇體積分?jǐn)?shù)由2%增至6%，產(chǎn)物 7α-OH-DHEA得率由 35%增加到42.12%，但過高濃度的丙二醇會(huì)對菌體生長產(chǎn)生影響，抑制細(xì)胞中羥化酶的活性，導(dǎo)致產(chǎn)物得率明顯降低。因此，丙二醇的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在6%。

圖8 丙二醇體積分?jǐn)?shù)對產(chǎn)物得率的影響Fig.8 Effects of propylene glycol concentrations on product yield

2.5 投料濃度對轉(zhuǎn)化的影響

底物DHEA加入量過少會(huì)導(dǎo)致微生物的羥化能力得不到充分利用，增加生物轉(zhuǎn)化的批次和成本，而過高濃度的底物對菌體有一定的毒害性，影響菌體正常的生長和代謝，導(dǎo)致菌體對底物的轉(zhuǎn)化能力下降，故需要選擇最適的底物添加濃度［15］。投料濃度對轉(zhuǎn)化的影響如圖9所示。由圖9可知，7α-OH-DHEA得率隨底物濃度的增加而顯著降低，底物質(zhì)量濃度較低時(shí)（1 g/L），產(chǎn)物得率最高，達(dá)56.78%。

圖9 底物投料質(zhì)量濃度對產(chǎn)物得率的影響Fig.9 Effects of substrate mass concentrations on product yield

2.6 底物投加時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響

羥化酶為誘導(dǎo)酶，能被底物誘導(dǎo)，故底物的添加時(shí)間往往對轉(zhuǎn)化效果產(chǎn)生顯著影響［16］。

因此，分別在赤霉菌生長不同時(shí)期加入底物，轉(zhuǎn)化過程取樣檢測，以轉(zhuǎn)化過程中的最高得率作為此條件下的產(chǎn)物得率，結(jié)果如表1所示（表中轉(zhuǎn)化周期指接種到轉(zhuǎn)化結(jié)束的時(shí)間）。由表1可知：在0 h時(shí)，即菌體開始培養(yǎng)時(shí)添加質(zhì)量濃度為1 g/L的底物，轉(zhuǎn)化36 h，此時(shí)產(chǎn)物得率最大，達(dá)到72.34%，高于初始條件下菌體培養(yǎng)24 h時(shí)添加底物。在該條件下既能對羥化酶進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，得到最高產(chǎn)物得率，同時(shí)也減少菌體培養(yǎng)時(shí)間，從而縮短了整個(gè)轉(zhuǎn)化周期，且菌體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化時(shí)間均短于文獻(xiàn)報(bào)道水平［10］。

表1 底物投加時(shí)間對產(chǎn)物得率的影響Table 1 Effects of feeding time on product yield

2.7 轉(zhuǎn)化過程分析

在最佳工藝條件下，對 Gibberella intermedia CA3-1轉(zhuǎn)化DHEA的過程進(jìn)行分析，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要在對數(shù)生長期后期至穩(wěn)定期快速生成，在36 h時(shí)，摩爾產(chǎn)物得率達(dá)到最高（72.34%）；轉(zhuǎn)化36 h后產(chǎn)物得率開始快速下降，分析其原因是由于產(chǎn)物繼續(xù)被轉(zhuǎn)化為其他副產(chǎn)物。因此，轉(zhuǎn)化時(shí)間控制在36 h利于目的產(chǎn)物的生成。

圖10 Gibberella intermedia CA3-1轉(zhuǎn)化DHEA的過程曲線Fig.10 Process curves of DHEA transformation by Gibberella intermedia CA3-1

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)探討了接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、有機(jī)溶劑助溶、投料濃度以及底物投加時(shí)間對產(chǎn)物7α-OH-DHEA生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6%接種量、裝液量30 mL（250 mL三角瓶）、轉(zhuǎn)速220 r/min、底物質(zhì)量濃度1 g/L條件下，用體積分?jǐn)?shù)6%丙二醇助溶，菌體開始培養(yǎng)時(shí)即投入底物，轉(zhuǎn)化時(shí)間36 h，此時(shí)產(chǎn)物收率最高，達(dá)到72.34%，高于文獻(xiàn)報(bào)道水平。作為 1株高羥化能力的新菌株，Gibberella intermedia CA3-1的培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)化周期短、投料工藝簡單、菌體形態(tài)均勻、副產(chǎn)物易分離，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。然而，對于工藝的溶料方式及添加因子、放大條件等因素還有待進(jìn)一步確定和優(yōu)化。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

C7α-hydroxylation of dehydroepiandrosterone by Gibberella intermedia CA3-1

FU Zhenzhen1，LI Heng2，LI Hui2，XU Zhenghong2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

We studied enzymatic C7-hydroxylation of dehydroepiandrosterone（DHEA）by Gibberella intermedia CA3-1.The single factor experiment was applied to determine the optimal fermentation conditions with the conversion rate of C7-hydroxylation as the criterion.The optimal biotransformation conditions were as follows：inoculation amount 6%（V/V），medium volume 30 mL（per 250 mL flask），rotation speed 220 r/min，DHEA concentration 1 g/L，co-solvent propylene glycol（6%，V/V），adding substrate at the same time with inoculation，and biotransformation time 36 h.The molar yield of 7α-OHDHEA from substrate DHEA was 72.34%.

biotransformation；7α-hydroxylation；dehydroepiandrosterone；steroid；Gibberella intermedia

TQ920.6

A

1672-3678（2015）01-0001-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.001

2013-12-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A211）；國家自然科學(xué)基金（21206055）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012127）

付珍珍（1989—），女，湖北宜昌人，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；李 會(huì)（聯(lián)系人），副教授，E-mail：lihui@jiangnan.edu.cn