徐 凱，張偉國

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

原生質(zhì)體融合選育耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌

徐 凱，張偉國

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

為獲得耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將具有優(yōu)良性狀的高產(chǎn)菌株W和耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌Y-711進(jìn)行融合，篩選耐高溫的高產(chǎn)檸檬酸生產(chǎn)菌。通過變色圈篩選得到融合株R502，在40℃培養(yǎng)72 h就可產(chǎn)酸118.7 g/L，其產(chǎn)酸量比親本菌株分別高10.5%和21.0%，培養(yǎng)時(shí)間分別減少14.3%和7.7%，該菌株遺傳穩(wěn)定。原生質(zhì)體融合是一種有效獲得耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌的方法。

原生質(zhì)體融合；黑曲霉；耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌株

檸檬酸，又名枸櫞酸，是生物體主要的代謝產(chǎn)物之一，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)中［1］。近年來，檸檬酸的需求量越來越大，因此，選育優(yōu)良性狀的檸檬酸生產(chǎn)菌株備受重視。當(dāng)前檸檬酸生產(chǎn)用菌株多為不耐高溫菌株，發(fā)酵生產(chǎn)過程中需要大量冷卻水控制發(fā)酵溫度，從而使生產(chǎn)成本居高不下。據(jù)武國慶等［2］測算，300 m3發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度每升高1℃，則每噸檸檬酸至少減少循環(huán)冷卻水量15.2 t。耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌生長快、代謝活力高、發(fā)酵周期短，有利于提高設(shè)備利用率，減少冷卻水用量，降低生產(chǎn)成本。但是，目前國內(nèi)外對檸檬酸生產(chǎn)菌株的研究多集中于利用物理、化學(xué)方法提高產(chǎn)量，忽略了對耐高溫菌株的研究，所以對其開展研究有一定的實(shí)際意義。

原生質(zhì)體融合是20世紀(jì)50年代發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的基因重組技術(shù)［3-4］，滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)則是原生質(zhì)體融合技術(shù)的一個(gè)重要發(fā)展［5］。滅活原生質(zhì)體融合就是利用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚韱我挥H株或雙親株的原生質(zhì)體，其某一位置的生理結(jié)構(gòu)產(chǎn)生微小損傷而失去再生能力。經(jīng)融合后，由于致死損傷部位的互補(bǔ)而形成再生的融合體［6］。因此，利用滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育耐高溫生產(chǎn)菌株具有可行性。

黑曲霉經(jīng)過多次物理誘變和化學(xué)誘變后，產(chǎn)量很難再提高。故筆者通過對黑曲霉原生質(zhì)體融合條件的研究，希望能夠打破長期誘變帶來的積累效應(yīng)，獲得耐高溫高產(chǎn)菌株，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉W和黑曲霉誘變株Y-711均保藏于工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。其中，黑曲霉W為35℃時(shí)產(chǎn)量較高、生產(chǎn)周期較長的菌株，但是在40℃時(shí)不產(chǎn)酸；誘變株Y-711為誘變得到的耐高溫菌株，生產(chǎn)周期較短，但產(chǎn)酸較低。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（PDA）（g/L）：葡萄糖20，馬鈴薯200，瓊脂20。0.1 MPa、121℃下滅菌20min。

選擇培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基補(bǔ)加0.04%溴甲酚綠。

菌絲生長培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基補(bǔ)加5 g/L酵母膏，5 g/L蛋白胨。

高滲培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基補(bǔ)加0.6 mol/L NaCl。

發(fā)酵培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%玉米粉液化液與清液按體積比1∶4混合，（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，K2HPO41 g/L。pH 4.0。0.1 MPa、121℃滅菌20min。

1.1.3 試劑

磷酸緩沖液（PBS）：0.2 mol/L磷酸緩沖液，加入0.4 mol/L NH4Cl；pH 6.0。

滲穩(wěn)劑：0.8 mol/L NaCl溶液。

酶液：蝸牛酶、溶菌酶和纖維素酶以質(zhì)量比1∶3∶7的比例用PBS溶液配制，用0.22μm濾膜除菌后于4℃冰箱過夜備用。

1.1.4 主要儀器

光學(xué)顯微鏡，上海滬杏光學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；全溫?fù)u床，太倉強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司；恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總酸的測定

發(fā)酵液經(jīng)定性濾紙過濾后吸取1mL，用0.142 9 mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定，所消耗的NaOH毫升數(shù)即為發(fā)酵液中檸檬酸的質(zhì)量濃度（g/L）［7］。

1.2.2 總糖的測定

發(fā)酵液經(jīng)過定性濾紙過濾，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用蒽酮硫酸法［8］測定。

1.2.3 還原糖的測定

發(fā)酵液經(jīng)過定性濾紙過濾，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［9］測定。

1.2.4 黑曲霉原生質(zhì)體的制備

1）菌絲培養(yǎng) 將在PDA斜面上生長旺盛的兩親本菌株孢子，制成孢子懸浮液，將其孢子含量稀釋至108個(gè)/mL。取0.1mL接種于菌絲生長培養(yǎng)基中，于35℃、200r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。

2）原生質(zhì)體的制備 3 000r/min離心5min，將菌絲與培養(yǎng)基分離，并用滲穩(wěn)劑洗滌2次，洗滌后置于離心管中。加入配制好的酶液，32℃恒溫水浴振蕩酶解2.5 h。用4層高級(jí)擦鏡紙過濾后，3 000r/min離心15min將濾液分離，用滲穩(wěn)劑洗滌3次后，重懸收集到的原生質(zhì)體［10］。

1.2.5 黑曲霉原生質(zhì)體滅活

將收集到的兩親株的原生質(zhì)體適當(dāng)稀釋，使其密度為105個(gè)/mL。在2個(gè)直徑9 cm的培養(yǎng)皿中分別加入5mL懸浮液。將培養(yǎng)皿置于15 W紫外燈下10 cm處，分別振搖照射1、3、6、9和12min，然后每皿取200μL涂布于高滲平板上，在35℃下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)［11］。并按上述步驟重復(fù)試驗(yàn)2次。按式（1）計(jì)算滅活率，選擇滅活率剛好達(dá)到100%時(shí)為最佳滅活條件。

1.2.6 原生質(zhì)體融合

將滅活后的雙親原生質(zhì)體等量混合于無菌離心管中，加入預(yù)熱的1mL聚乙二醇（PEG）6 000溶液，混勻后于35℃恒溫水浴搖床上振蕩10min，然后用滲穩(wěn)劑洗滌離心。稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布多個(gè)高滲平板，在35℃下培養(yǎng)3～5 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按式（2）計(jì)算融合率。

式中：A表示融合后涂布的高滲平板，B表示滅活前雙親等量混合后接種的高滲平板。

1.2.7 融合株的篩選

將融合后的菌株點(diǎn)種到選擇培養(yǎng)基上，40℃下培養(yǎng)3～5 d，挑選變色圈較大的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，然后從中挑選產(chǎn)酸較高的菌株。

1.2.8 融合株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將產(chǎn)酸較高的菌株進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，并分別測其產(chǎn)酸量，以此來確定其是否具有遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉雙親株的紫外滅活結(jié)果

通過對高滲平板上的菌落計(jì)數(shù)，按照式（1）計(jì)算滅活率，得到黑曲霉雙親株的紫外滅活數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 黑曲霉雙親株紫外滅活結(jié)果Fig.1 UV-inactivated results of parent Aspergillus niger strain

由圖1可知：黑曲霉雙親株在15 W紫外燈下10 cm處振搖照射6min后，滅活率都剛好到達(dá)100%。為了防止照射紫外時(shí)間過長引起黑曲霉原生質(zhì)體嚴(yán)重?fù)p傷，因此選擇滅活率剛好達(dá)到100%為最佳條件。

2.2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

對原生質(zhì)體融合有影響的因素有很多，但是PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是其中較為重要的一個(gè)。如果PEG濃度太低，滲透壓就較低，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂，而且也不利于原生質(zhì)體相互靠近而融合。但是如果PEG濃度過高，又會(huì)引起原生質(zhì)體的皺縮和中毒。因此，考察PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對原生質(zhì)體融合的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對融合率的影響Fig.2 Effect of PEG mass concentration on fusion rate

由圖2可知：當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于45%時(shí)，由于滲透壓較低，原生質(zhì)體融合相對來說較為困難。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于45%時(shí)，由于溶液濃度過高，對原生質(zhì)體的損害開始出現(xiàn)，使得融合率開始下降。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，原生質(zhì)體的融合率最高。故選擇45%的PEG對原生質(zhì)體進(jìn)行融合。

2.3 融合時(shí)間的選擇

融合時(shí)間的長短對于原生質(zhì)體融合同樣非常重要，因此，考察融合時(shí)間對融合率以及再生的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 融合時(shí)間對融合率的影響Fig.3 Effect of fusion time on fusion rate

由圖3可知：融合率隨著融合時(shí)間的延長先增大后減小，當(dāng)融合時(shí)間為10min時(shí)，融合率最高。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因是如果融合時(shí)間過短，參與融合的原生質(zhì)體數(shù)量不多而且不穩(wěn)定，然后用滲穩(wěn)液洗滌，又使得剛開始融合的原生質(zhì)體被分開，從而導(dǎo)致融合率偏低；如果融合時(shí)間過長，PEG對原生質(zhì)體產(chǎn)生毒害作用，不利于原生質(zhì)體的再生，從而降低融合率。

2.4 融合溫度的選擇

考察融合溫度對原生質(zhì)體融合率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對融合率的影響Fig.4 Effect of temperature on fusion rate

由圖4可知：隨著融合溫度的升高，融合率先升高后下降，當(dāng)融合溫度為35℃時(shí)，融合率最高。這可能是因?yàn)楦邷乜梢越档蚉EG的黏度，增加細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性，從而有利于融合，使融合率上升。但是如果溫度過高，則會(huì)對原生質(zhì)體產(chǎn)生很大的損傷，而不利于原生質(zhì)體的融合，使融合率下降。

2.5 融合菌株的篩選

融合結(jié)束后，經(jīng)過選擇培養(yǎng)基初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，篩選產(chǎn)酸較高的菌株。多次進(jìn)行原生質(zhì)體融合后，總共篩選得到5株產(chǎn)酸較高的菌株，其產(chǎn)酸能力如表1所示。

表1 各菌株的總酸產(chǎn)量Table 1 Total acid production of the strains

2.6 菌株遺傳的穩(wěn)定性

分別對篩選得到的5株菌，傳代5次并分別測其產(chǎn)酸量，以此考察菌株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 菌株遺傳穩(wěn)定性結(jié)果Fig.5 Results of genetic stability of fusion strains

由圖5可知：菌株R502和R811產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)有退化現(xiàn)象，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。其中R502產(chǎn)酸較高，故選為目的菌株。

2.7 融合菌株與親株的產(chǎn)酸性能和耗糖性能比較

考察融合菌株與親株的產(chǎn)酸性能和耗糖性能，結(jié)果如圖6所示。

圖6 融合菌株和親株產(chǎn)酸與耗糖能力的比較Fig.6 Comparison of acid production and sugar comsuptin of fusion strain and parental stains

由圖6可知：3株菌在產(chǎn)酸和耗糖方面具有一致性。即在發(fā)酵前18 h，產(chǎn)酸和耗糖較少，此時(shí)菌體處于分生孢子膨脹和萌發(fā)階段。發(fā)酵24 h左右菌體進(jìn)入對數(shù)期，耗糖快速增加，產(chǎn)酸量較少，主要原因是此時(shí)糖主要用于菌體生長。之后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)酸量和耗糖都大幅度增加，這一時(shí)期是檸檬酸積累的主要時(shí)期。在72 h左右，糖的濃度已經(jīng)較低，菌體生長較緩慢，檸檬酸的積累開始變少，這時(shí)發(fā)酵基本接近終點(diǎn)。在結(jié)束發(fā)酵時(shí)，三菌株總糖和還原糖含量都基本相同，但是融合菌株R502在總酸產(chǎn)量和耗糖速率上都優(yōu)于親株。因此，融合株R502產(chǎn)量較高，生產(chǎn)周期較短。

對于檸檬酸生產(chǎn)菌的選育，較為有名的是上海工業(yè)微生物研究所選育的黑曲霉Co-827［12］，該菌株在200 g/L初糖中35℃發(fā)酵4 d，產(chǎn)酸可高達(dá)180 g/L。而耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌較為有名的為金其榮等［13］以黑曲霉H-142為出發(fā)菌株，采用γ線、硫酸二乙酯及高溫?zé)崽幚韱为?dú)或復(fù)合誘變，篩選得到的菌株HQL-601，其可在40℃發(fā)酵60 h產(chǎn)酸130 g/L。本文中，筆者篩選得到的菌株與以上兩菌相比，產(chǎn)酸水平還有一定的差距，但是生產(chǎn)周期比黑曲霉Co-827在35℃時(shí)發(fā)酵的周期要短，因此也具有一定的實(shí)際意義。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)確定了黑曲霉雙親株紫外滅活的最佳時(shí)間和融合的最優(yōu)條件，即：紫外照射6min，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%，在35℃下融合10min。在此條件下，篩選得到了穩(wěn)定遺傳的融合株R502，在40℃培養(yǎng)72 h就可產(chǎn)酸118.7 g/L，總酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率都優(yōu)于親株。在誘變過程中，誘變株Y-711通過各種誘變方法已經(jīng)很難再大幅提高產(chǎn)量，但是通過此實(shí)驗(yàn)，其產(chǎn)量再次大幅提高，從而打破了長期誘變的積累效應(yīng)，對實(shí)際生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)、應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

High temperature resistant critic acid producing strain breeding by protoplast fusion

XU Kai，ZHANG Weiguo
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To obtain high temperature resistant critic acid producing strain，the protoplast of high-yield strain W and high temperature resistant mutant strain Y-711 were fused.The obtained fusion strain R502 produced 118.7 g/L acid after cultivation at 40℃ for 72 h.The acid yield of stain R502 increased 10.5%compared with strain W and 21.0%compared with strain Y-711，respectively.Cultivation time reduced 14.3%compared to strain W and 7.7%compared to strain Y-711，respectively.The strain R502 was genetically stable.Protoplast fusion is an effective method to obtain a high temperature resistant citric acid producing strain.

protoplast fusion；Aspergillus niger；high temperature resistant critic acid producing strain

Q784

A

1672-3678（2015）05-0026-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.005

2014-10-10

國家自然科學(xué)基金（31171640）

徐 凱（1988—），男，山東淄博人，碩士研究生，研究方向：菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化；張偉國（聯(lián)系人），教授，E-mail：zhangwg168@ 126.com