豐文飛，歐志敏，沈紹傳，贠軍賢

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院 綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310032）

凍融產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備三磷酸腺苷

豐文飛1，歐志敏1，沈紹傳2，贠軍賢2

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院 綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310032）

微生物發(fā)酵和酶轉(zhuǎn)化法是工業(yè)上制備三磷酸腺苷（ATP）的有效途徑。以腺嘌呤為關(guān)鍵底物，用凍融通透化處理的產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備ATP，用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)ATP含量，考察各種轉(zhuǎn)化條件對(duì)ATP產(chǎn)率的影響，確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件：菌體用量40 g/L，底物6 g/L，葡萄糖60 g/L，MgSO415 mmol/L，KH2PO4120 mmol/L，反應(yīng)液pH 7.4，反應(yīng)溫度35℃。在最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下，ATP產(chǎn)率達(dá)到85.00%，比優(yōu)化前提高了58%，細(xì)胞用量大幅度降低，優(yōu)化條件穩(wěn)定可行。

產(chǎn)氨棒桿菌；三磷酸腺苷；生物轉(zhuǎn)化；腺嘌呤

三磷酸腺苷（ATP）是生物體內(nèi)能量交換的中心物質(zhì)，在臨床上被廣泛用于肌肉萎縮、心肌梗塞、肝炎等疾病和各種急救病癥的治療［1-3］，還具有抗疲勞的功效，有助于運(yùn)動(dòng)員增加能量［4］。此外，ATP在環(huán)保［5］及衛(wèi)生監(jiān)測(cè)［6］等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。ATP的國(guó)內(nèi)外需求量大，對(duì)其進(jìn)行生物體外合成的研究具有重要意義。

ATP的傳統(tǒng)制備方法有動(dòng)物肌肉提取法［7］、光合磷酸法［8］、酶催化合成法［9-10］及一磷酸腺苷（AMP）化學(xué)合成法［11］等，但成本或環(huán)境污染等問(wèn)題限制了其在工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。近幾年，工業(yè)化制備主要集中于微生物轉(zhuǎn)化法或酶轉(zhuǎn)化法，如以腺苷或AMP等為主要底物，用啤酒酵母、面包酵母、產(chǎn)氨棒桿菌和霉菌等微生物可以合成ATP［12-13］。

張國(guó)睿等［14］以腺嘌呤為底物，用固定化酵母轉(zhuǎn)化合成ATP，細(xì)胞用量400 g/L。Tanaka等［15］將產(chǎn)氨短桿菌ATCC6872接入培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的第3天投入腺嘌呤，在上清液中分別生成了1.37 mg/mL的ATP和一定量的二磷酸腺苷（ADP）、AMP。朱家榮等［16］用固定化酵母轉(zhuǎn)化腺嘌呤合成 ATP。Kadowakib等［17］用細(xì)菌和面包酵母混合發(fā)酵，65%的腺嘌呤轉(zhuǎn)化為ATP。程金芬等［18］用短桿菌B1-787和酵母混合發(fā)酵腺嘌呤生產(chǎn)ATP。Fujio等［19-20］和Maruyama等［21］曾用產(chǎn)氨短桿菌KY13510轉(zhuǎn)化腺嘌呤，細(xì)胞用量100～120 g/L，又通過(guò)添加聚氧乙烯硬脂胺（POESA）和二甲苯起始酶促反應(yīng)，以Na2HPO4作磷酸基團(tuán)供體，用發(fā)酵法制備ATP，產(chǎn)率為82%。Zhu等［22］用霉菌以腺嘌呤為底物合成ATP。但是，發(fā)酵法生產(chǎn)ATP反應(yīng)時(shí)間過(guò)久，需定時(shí)定量投加各種反應(yīng)物，為增加細(xì)胞通透性還需添加表面活性劑，大量菌體發(fā)酵會(huì)消耗過(guò)多培養(yǎng)原料，增加投入成本，同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜，增加產(chǎn)物的分離難度，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不可控因素較多，對(duì)設(shè)備要求較高。轉(zhuǎn)化法相對(duì)來(lái)說(shuō)簡(jiǎn)單易行，產(chǎn)物也比較單一，便于后續(xù)分離。

筆者以腺嘌呤為底物，不使用表面活性劑，用凍融通透化處理的產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes）轉(zhuǎn)化法制備ATP，采用高效液相色譜（HPLC）法監(jiān)測(cè)產(chǎn)物生成動(dòng)態(tài)。用單因素試驗(yàn)考察初始細(xì)胞用量、底物濃度、葡萄糖濃度、MgSO4濃度、KH2PO4濃度、反應(yīng)液pH和反應(yīng)溫度等多種因素對(duì)ATP產(chǎn)量的影響，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，以提高ATP產(chǎn)率和底物轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

C.ammoniagenes CICC10168購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基［21］（g/L）：蛋白胨10，NaCl 5，牛肉膏5，瓊脂25。pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 2.5，MgSO42，KH2PO41，尿素2.5。pH 7.2～7.4，115℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 80，酵母膏 10，KH2PO415，K2HPO4·3H2O 15，MgSO410，CaCl20.1，尿素4，MnSO40.02。pH 7.2～7.4，115℃滅菌20min。

1.1.3 主要試劑及儀器

腺嘌呤和ATP二鈉鹽，上海生工生物工程有限公司；色譜純甲醇，Sigma-Aldrich公司；其余試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent 1260型高效液相色譜儀（HPLC），美國(guó)安捷倫公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HZ-2011K-A型恒溫?fù)u床，太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 C.ammoniagenes CICC10168生長(zhǎng)曲線

凍干管種子F0接種固體培養(yǎng)基，經(jīng)斜面活化后作為F1代種子，再經(jīng)斜面活化作為F2代。從F2代斜面挑取少量菌體，接種于種子培養(yǎng)基中，平行3個(gè)樣，每小時(shí)取樣500μL，稀釋10倍至5mL，于600nm處測(cè)定吸光值（OD600），繪制菌體生長(zhǎng)曲線［23］。

1.2.2 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體作為種子，以10%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃搖床160r/min培養(yǎng)48 h，8 000r/min離心10min后，濕菌體-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 凍融法提高細(xì)胞的通透性

離心后的菌體置于-20℃冰箱冷凍4 d，取出后室溫下融解，再放置于-20℃冰箱冷凍，稍后取出，室溫融解，此過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.4 凍融細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備ATP單因素試驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)凍融處理后的產(chǎn)氨棒桿菌接種于反應(yīng)液中，接種量為40 g/L。在文獻(xiàn)［24］基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)，反應(yīng)液組成：葡萄糖 80 g/L，KH2PO4240 mmol/L，MgSO420 mmol/L，腺嘌呤6 g/L，KOH調(diào)pH 7.0。將10mL轉(zhuǎn)化液置于50mL錐形瓶中放入搖床（32℃，160r/min）反應(yīng)。取樣離心（8 000r/min，5min），稀釋后采用HPLC法檢測(cè)含量。

其他組分不變，分別改變底物和葡萄糖的質(zhì)量濃度以及KH2PO4和MgSO4的濃度，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最佳底物濃度、最佳葡萄糖濃度、最佳KH2PO4濃度、最佳MgSO4濃度4個(gè)因素為考察對(duì)象，采用“四因素三水平”方案進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究影響ATP產(chǎn)率的因素，以期獲得最佳的轉(zhuǎn)化條件。

1.2.6 分析方法

采用高效液相色譜法檢測(cè)ATP含量，色譜柱為C18柱（5μm，4.6 mm×150 mm）。流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（A）和甲醇（B）（體積比95∶5），磷酸鹽緩沖液為35 mmol/L Na2HPO4和15 mmol/L KH2PO4，pH 6.5。檢測(cè)波長(zhǎng) 259nm。流動(dòng)相的流速為 0.3mL/min、柱溫25℃、進(jìn)樣量20μL。

在文獻(xiàn)［25］分析條件基礎(chǔ)上，用梯度洗脫模式，設(shè)置時(shí)間程序：0min，V（A）∶V（B）=95∶5；7min，V（A）∶V（B）=95∶5；8min，V（A）∶V（B）=70∶30；20min，V（A）∶V（B）=70∶30；25min，V（A）∶V（B）=95∶5。

1.2.7 ATP收率和底物轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

分別配制不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)液和腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)液，HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，ATP的回歸方程為Y1=91.521X1+47.276，r1=0.999；腺嘌呤回歸方程為Y2=359.96X2-2.733，r2=0.999。計(jì)算ATP和腺嘌呤濃度，再計(jì)算ATP收率和腺嘌呤轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 C.ammoniagenes CICC10168的生長(zhǎng)曲線和對(duì)數(shù)期的確定

實(shí)驗(yàn)前，首先對(duì)產(chǎn)氨棒桿菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為8～20 h。0～8 h是菌體生長(zhǎng)的延遲期，20 h后菌種生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行接種，用于菌種的大規(guī)模培養(yǎng)，本文中，采用生長(zhǎng)18 h的菌體作為種子用于擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.2 底物濃度的影響

在HPLC條件下，發(fā)現(xiàn)兩目標(biāo)物的分離效果良好。選取腺嘌呤質(zhì)量濃度為3、4、5、6、7和8 g/L分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，基礎(chǔ)反應(yīng)液其他成分不變，反應(yīng)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：底物質(zhì)量濃度從3 g/L增加到6 g/L，ATP的生成隨之增加，6 g/L時(shí)達(dá)到峰值，再繼續(xù)增加底物的量，對(duì)產(chǎn)物ATP生成不利，可能過(guò)量的底物對(duì)產(chǎn)物的生成有抑制作用；從底物腺嘌呤轉(zhuǎn)化率指標(biāo)分析，雖然低濃度時(shí)接近完全轉(zhuǎn)化，但ATP產(chǎn)量和產(chǎn)率不高，因?yàn)榈蜐舛葧r(shí)底物反應(yīng)量不充足。綜上考慮，選擇底物質(zhì)量濃度為6 g/L進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 底物濃度對(duì)ATP濃度和產(chǎn)率的影響Fig.1 Effects of substrate concentration on ATP concentration and yield

圖2 葡萄糖濃度對(duì)ATP濃度和產(chǎn)率的影響Fig.2 Effects of glucose concentration on ATP concentration and yield

2.3 葡萄糖濃度的影響

葡萄糖作為產(chǎn)氨棒桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的碳源，對(duì)底物的轉(zhuǎn)化效率有重要影響。基礎(chǔ)反應(yīng)液其他成分不變，改變葡萄糖質(zhì)量濃度（20、40、60、80、100和120 g/L）進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，考察ATP產(chǎn)量和產(chǎn)率的變化，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：葡萄糖質(zhì)量濃度從20 g/L增至60 g/L，ATP的生成量隨之增加，在60 g/L葡萄糖時(shí)達(dá)到峰值，ATP產(chǎn)量和產(chǎn)率均較高；繼續(xù)增加葡萄糖的量，對(duì)產(chǎn)物生成不利，葡萄糖質(zhì)量濃度超過(guò)60 g/L時(shí)，ATP的含量反而降低，其主要原因可能是微生物代謝葡萄糖需消耗ATP。因此，選擇葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L。

2.4 Mg2+濃度的影響

Mg2+是很多酶的輔酶或輔助因子，是影響酶活的主要離子之一。Luthi等［26］研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+會(huì)螯合等摩爾的ATP，因此，產(chǎn)氨棒桿菌對(duì)底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的過(guò)程中保證Mg2+的供給非常重要?？疾?～30 mmol/L范圍內(nèi)不同Mg2+濃度對(duì)ATP生成的影響，結(jié)果如圖 3所示。由圖 3可知：Mg2+濃度為 20 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物的產(chǎn)量和產(chǎn)率達(dá)到峰值。

圖3 Mg2+濃度對(duì)ATP濃度和產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of magnesianion concentration on ATP concentration and yield

2.5 KH2PO4濃度的影響

產(chǎn)氨棒桿菌轉(zhuǎn)化腺嘌呤合成ATP是連續(xù)的磷酸化過(guò)程，因而KH2PO4的濃度是影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中ATP產(chǎn)率的重要因素之一。筆者采用KH2PO4作為磷酸基團(tuán)的供體，研究40～240 mmol/L范圍內(nèi)KH2PO4濃度對(duì)ATP生成的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：隨著KH2PO4濃度的增加，產(chǎn)物ATP的量也在不斷增加，KH2PO4濃度為120 mmol/L時(shí)，ATP的產(chǎn)量達(dá)到最佳值，此后磷酸鹽濃度繼續(xù)增加，ATP的產(chǎn)量不會(huì)繼續(xù)提高。因此，KH2PO4的最佳濃度為120 mmol/L。

圖4 KH2PO4濃度對(duì)ATP濃度和產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of KH2PO4concentration on ATP concentration and yield

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最佳的底物濃度、葡萄糖濃度、KH2PO4濃度及MgSO4濃度這4個(gè)因素為考察對(duì)象，采用“四因素三水平”方案進(jìn)行正交試驗(yàn)，以期獲得最佳的轉(zhuǎn)化條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析如表1和表2所示。

極差值的大小表明該因素水平的改變對(duì)結(jié)果的影響大小，極差值越大，該因素對(duì)ATP產(chǎn)率的影響越大。由表2可知：各因素對(duì)ATP產(chǎn)率的影響從大到小依次為腺嘌呤、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4。為了獲得最大的產(chǎn)率，應(yīng)選擇的最優(yōu)組合是腺嘌呤6 g/L、葡萄糖60 g/L、MgSO415 mmol/L和 KH2PO4120 mmol/L，采用此組合進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，ATP平均產(chǎn)率達(dá)到78%，比優(yōu)化前（基礎(chǔ)反應(yīng)液，ATP產(chǎn)量12.30 g/L，產(chǎn)率54%）提高了46%。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of the orthogonal experiments

表2 正交試驗(yàn)極差分析Table 2 Range analysis of the orthogonal experiment

2.7 初始pH的影響

產(chǎn)氨棒桿菌C.ammoniagenes CICC10168的最適生長(zhǎng)pH為7.2～7.4（菌種保藏中心提供），因此，筆者在pH 6.8～7.8范圍內(nèi)取6個(gè)梯度來(lái)考察pH對(duì)產(chǎn)物生成的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：在菌體最適生長(zhǎng)pH范圍內(nèi)，產(chǎn)物的生成幾乎不受影響；而超出最適生長(zhǎng)pH范圍，pH都對(duì)產(chǎn)物的生成不利，所以菌體最適生長(zhǎng)pH也是C.ammoniagenes CICC10168制備ATP最優(yōu)的pH。因此，確定產(chǎn)ATP的最佳pH為7.4。

2.8 轉(zhuǎn)化溫度的影響

C.ammoniagenes CICC10168最高耐熱溫度為42℃，因此，考察30～42℃范圍內(nèi)不同溫度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：溫度超過(guò)40℃后，ATP的產(chǎn)量下降，可能是部分酶活性受到了影響，從而阻礙了產(chǎn)物的生成。由此可見(jiàn)，35℃對(duì)產(chǎn)物的生成最為有利。

2.9 最佳接種量的選擇

選擇凍融菌體量分別為20、30、40、50和60 g/L，其他條件不變，研究接種量對(duì)ATP濃度和產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖7所示。因腺嘌呤溶解度限制，菌體用量20 g/L時(shí)反應(yīng)結(jié)束，然而腺嘌呤并未完全溶解，所以轉(zhuǎn)化量不能確定，產(chǎn)物產(chǎn)率無(wú)法計(jì)算，故圖7中沒(méi)有相應(yīng)數(shù)據(jù)。從圖7可以看出：菌體用量40 g/L時(shí)，已經(jīng)完成底物的最大轉(zhuǎn)化，繼續(xù)增加菌體用量對(duì)產(chǎn)物生成不利，可能是因?yàn)檫^(guò)量的菌體自身代謝消耗了轉(zhuǎn)化液中原料，阻礙了底物的轉(zhuǎn)化，所以選取40 g/L為菌體的最佳用量。

圖6 溫度對(duì)ATP濃度和產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of temperature on ATP concentration and yield

圖7 菌體用量對(duì)ATP濃度和產(chǎn)率的影響Fig.7 Effects of cell amount on ATP concentration and yield

圖8 最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中ATP含量、菌體量和ATP產(chǎn)率的動(dòng)態(tài)變化Fig.8 Variations of ATP concentrations，cell concentrations and ATP yield during the reaction process under the optimal conditions

2.10 最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下的轉(zhuǎn)化反應(yīng)

按上述試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件，即腺嘌呤6 g/L、葡萄糖60 g/L、MgSO415 mmol/L、KH2PO4120 mmol/L、pH 7.4和35℃，投加40 g/L凍融菌體進(jìn)行反應(yīng)，取樣檢測(cè)ATP含量及菌體量的變化，結(jié)果如圖8所示。由圖8可見(jiàn)：隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物ATP在逐漸積累，在8 h時(shí)左右達(dá)到最大積累量（19.5 g/L），ATP產(chǎn)率85%。菌體量隨反應(yīng)進(jìn)行在緩慢增加，這是因?yàn)閮鋈诜ㄌ幚砑?xì)胞只是增加了細(xì)胞的通透性，并沒(méi)有破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞亦沒(méi)有凋亡。底物進(jìn)入細(xì)胞后，利用細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈的酶系統(tǒng)進(jìn)行一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化得到ATP。未衰亡的細(xì)胞接受底物利用葡萄糖、磷酸鹽和Mg2+實(shí)現(xiàn)有氧呼吸，產(chǎn)生ATP的過(guò)程也出現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)現(xiàn)象（一般情況下細(xì)胞的生長(zhǎng)是利用營(yíng)養(yǎng)要素和呼吸作用提供的能量來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體積的增加），所以在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的過(guò)程中，細(xì)胞量呈現(xiàn)出了緩慢的增長(zhǎng)趨勢(shì)。新增長(zhǎng)的細(xì)胞因通透性差，幾乎不參與底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轉(zhuǎn)化起始階段與轉(zhuǎn)化完成后的反應(yīng)液的HPLC色譜圖如圖9所示。由圖9可知：轉(zhuǎn)化產(chǎn)物比較單一，為后續(xù)的分離提供了很大的便利，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

圖9 反應(yīng)初始階段與完成后的HPLC譜圖Fig.9 HPLC analysis of ATP and adenine content at the initial and final stages in the reaction

在條件優(yōu)化后，反應(yīng)液中ATP質(zhì)量濃度為19.46 g/L，相對(duì)原始對(duì)照（12.30 g/L）提高了58%。比較本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果的差異，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：本研究中，ATP產(chǎn)率達(dá)85.00%，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率為90%，凍融菌體接種量40 g/L，這些工藝條件在國(guó)內(nèi)外都處于較優(yōu)水平，為 ATP的工業(yè)生產(chǎn)提供良好借鑒。

表3 腺嘌呤轉(zhuǎn)化合成三磷酸腺苷成果比較Table 3 Comparison of transformation achievement for synthesis of ATP from adenine in references

3 結(jié)論

本研究不使用表面活性劑，直接用凍融細(xì)胞轉(zhuǎn)化腺嘌呤制備ATP，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了ATP的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件：菌體接種量40 g/L、底物腺嘌呤6 g/L、葡萄糖60 g/L、MgSO415 mmol/L、KH2PO4120 mmol/L、反應(yīng)液 pH 7.4和反應(yīng)溫度35℃。最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下，ATP產(chǎn)率可達(dá)85.00%，底物轉(zhuǎn)化率為90%。該優(yōu)化條件穩(wěn)定可行，所用菌體量少，菌體處理容易，轉(zhuǎn)化耗時(shí)短，過(guò)程簡(jiǎn)單容易控制，實(shí)現(xiàn)了原料定量投入與ATP較高產(chǎn)出的目標(biāo)。這表明C.ammoniagenes在制備ATP方面有優(yōu)勢(shì)，可為ATP的工業(yè)生產(chǎn)提供良好借鑒。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Preparation of ATP by permeable Corynebacterium ammoniagenes cells with frozen-thawed processing

FENG Wenfei1，OU Zhimin1，SHEN Shaochuan2，YUN Junxian2
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology，College of Chemical Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

In industrial process，ATP can be produced by fermentation with microbial strains or biotransformation with enzymes.In this work，permeable Corynebacterium ammoniagenes cells with frozenthawed processing were used to synthesize ATP using adenine as the primary substrate.The preparation conditions were studied experimentally and ATP concentration in the culture broth was detected by high performance liquid chromatography（HPLC）.The optimum condition was observed，i.e.，wet cells 40 g/L，adenine 6 g/L，glucose 60 g/L，MgSO415 mmol/L，KH2PO4120 mmol/L，pH 7.4 and the reaction temperature at 35℃.As a result，adenine was biotransformed successfully into ATP with the yield about 85.00%，which was 58%higher than that before the optimization.The amount of cells needed in the present process was much less than those without frozen-thawed processing.The optimum conditions obtained were stable and feasible.

Corynebacterium ammoniagenes；adenosine triphosphate；biotransformation；adenine

TQ92

A

1672-3678（2015）05-0001-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.001

2014-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（21036005）；科技部中歐政府間國(guó)際合作專項(xiàng)（1017）；浙江省自然科學(xué)基金（LZ14B060001）

豐文飛（1987—），女，安徽桐城人，碩士研究生，研究方向：微生物制藥；歐志敏（聯(lián)系人），教授，E-mail：oozzmm@zjut.edu.cn