孫文鵬　韓在虹　孫瑜　高明△

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116622；2.黑龍江省齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161005）

·研究報告·

正交試驗(yàn)法優(yōu)選溫?zé)崆蹇诜禾崛」に?

孫文鵬1韓在虹2孫瑜2高明1△

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116622；2.黑龍江省齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161005）

目的優(yōu)選溫?zé)崆蹇诜旱奶崛」に?。方法采用正交試?yàn)，以揮發(fā)油含量為指標(biāo)，考察藥材蒸餾時間、料液比、超聲時間3因素對揮發(fā)油提取的影響；以綠原酸含量和浸膏得率為綜合指標(biāo)，篩選提取工藝條件。結(jié)果優(yōu)選的揮發(fā)油提取工藝為蒸餾4 h，加8倍量水，超聲60 min；最佳提取工藝為加12倍量水煎煮3次，煎煮時間為50 min。結(jié)論該提取工藝合理、穩(wěn)定，為溫?zé)崆蹇诜汗I(yè)生產(chǎn)提供參考。

溫?zé)崆蹇诜赫辉囼?yàn)綠原酸提取工藝

溫?zé)崆蹇诜菏驱R齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院針對急性外感熱病研制的復(fù)方中藥制劑，由石膏、赤芍、連翹、柴胡、金銀花、薄荷、魚腥草和荊芥8味中藥組成。臨床應(yīng)用已有10余年，療效顯著［1］，但其提取工藝方面的報道少。原提取工藝采用均勻設(shè)計法［2］，以芍藥苷為指標(biāo)對水提工藝進(jìn)行考察。本文對原提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，以超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，采用正交設(shè)計法以綠原酸含量及浸膏得率為綜合指標(biāo)，篩選最佳提取工藝。

1　儀器與材料

1.1儀器L-2130高效液相色譜儀（日本日立HITACHI）、V-detector L-2400檢測器（日本日立HITACHI）；N-2000色譜數(shù)據(jù)工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程研究所）、E-202F電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）、HH-S112電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、KH2200DB超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）等。

1.2試藥石膏購自遼寧，柴胡購自內(nèi)蒙古，金銀花購自河南，魚腥草、連翹購自陜西，薄荷、荊芥購自安徽，赤芍購自甘肅，均經(jīng)大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)中藥學(xué)系高松副教授鑒定均為真品。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院，批號110753-200413；乙腈和甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1正交試驗(yàn)法提取揮發(fā)油

2.1.1正交試驗(yàn)設(shè)計選擇蒸餾時間（A）、料液比（B）、超聲時間（C）為主要影響因素，每個因素選擇3個水平，以揮發(fā)油含量為指標(biāo)，按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，考察揮發(fā)油提取工藝。見表1。

2.1.2試驗(yàn)方法按處方分別稱取柴胡、金銀花、薄荷、魚腥草和荊芥藥材粗粉加入2000 mL圓底燒瓶中，按表1的料液比加入蒸餾水與沸石數(shù)粒，振搖均勻，浸泡30 min后超聲波處理，圓底燒瓶與揮發(fā)油測定器、

表1　揮發(fā)油提取因素水平

表2　揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3方差分析通過SPSS11.5軟件對揮發(fā)油的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3　揮發(fā)油提取方差分析

通過對表2、表3 3個因素的極差R進(jìn)行比較，可知：RC＞RA＞RB，3個因素對揮發(fā)油提取工藝的影響程度依次為C＞A＞B，其中超聲時間和蒸餾時間對揮發(fā)油提取得率的影響較大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），料液比對揮發(fā)油提取得率的影響不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因素C選擇最佳水平3，因素A選擇最佳水平3，因?yàn)橐蛩谺水平間差異較小，所以選擇水平2，因此確定揮發(fā)油提取的最佳工藝為A3B2C3，即蒸餾4 h，料液比1∶8，超聲時間為60 min。

2.1.4驗(yàn)證試驗(yàn)按正交試驗(yàn)篩選的最佳提取工藝A3B2C3進(jìn)行試驗(yàn)重復(fù)3次，3次試驗(yàn)的揮發(fā)油含量分別為108.10、107.50、108.70 mg，平均值為108.10 mg，RSD為0.56%。說明此提取條件下得到的揮發(fā)油得率較高，穩(wěn)定可行。

2.2水提工藝的正交試驗(yàn)組方藥材所含化學(xué)成分主要為黃酮類、皂苷類和有機(jī)酸類等極性成分，口服液工業(yè)生產(chǎn)中要本著節(jié)能高效的原則，所以綜合考慮以水煎煮法為提取方法。

2.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計根據(jù)藥材的性質(zhì)及結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)考慮，選擇加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為主要考察因素，每個因素選3個水平，以浸膏得率和綠原酸含量為綜合指標(biāo)，按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，考察水提最佳工藝。見表4。

表4　水提法因素水平

2.2.2樣品溶液的制備處方組成：石膏110 g，赤芍、連翹、柴胡、薄荷和荊芥各12 g，金銀花15 g，魚腥草23 g。稱處方量的藥材9份，粉碎成粗粉，加蒸餾水浸泡30 min，按照正交表進(jìn)行試驗(yàn)。其中石膏先煎30 min，柴胡、金銀花、薄荷、魚腥草和荊芥提取揮發(fā)油后藥渣與其他藥材共同煎煮。煎煮后的藥液用8層紗布過濾，濾液減壓濃縮后定容至300 mL，密封備用。

2.2.3浸膏得率的測定將2.2.2項下得到的樣品提取液，各精密量取20 mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣置于105℃干燥箱中5 h，干燥至恒重，取出，迅速置于干燥器中放冷后迅速精密稱重，按以下公式計算浸膏得率：浸膏得率=（VW1/20W）×100%。公式中，V為每份藥材提取液總體積，W1為20 mL提取液的浸膏質(zhì)量，W為每份藥材的質(zhì)量。

2.2.4含量測定（1）色譜條件。色譜柱：Diamonsil鉆石C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.4%磷酸（1∶9），流速1 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量10 μL。（2）對照品溶液的制備。精密稱取綠原酸對照品2.07 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解，超聲5 min，并稀釋至刻度，搖勻，即為對照品溶液，用0.45 μm有機(jī)系微孔濾器濾過，取續(xù)濾液備用（4℃保存）。（3）供試品溶液的制備。取各供試品溶液10 mL離心，精密吸取2 mL置于25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解，超聲5 min，并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm有機(jī)系微孔濾器濾過，取續(xù)濾液即得。（4）陰性樣品溶液的制備。稱取處方組成中除金銀花外的其余藥材，按照生產(chǎn)工藝制備陰性樣品，并按“2.2.4（3）”項下方法制備，即得陰性樣品溶液。（5）專屬性試驗(yàn)。取“2.2.4”項下的對照品、供試品及陰性樣品溶液各10μL按“2.2.4（1）”項下的色譜條件進(jìn)行測定，綠原酸色譜峰與供試品中其他組分的色譜峰分離良好，陰性樣品溶液的色譜峰對綠原酸的測定無干擾，見圖1。（6）線性范圍考察。精密吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液2、4、6、8、10 μL依次進(jìn)樣，以綠原酸含量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y= 3.1E+9X+13300（r=0.99905），其線性范圍為0.1656～0.8280 μg。（7）精密度試驗(yàn)。精密吸取同一對照品溶液10 μL注入高液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，按“2.2.4（1）”項下色譜條件測定綠原酸峰面積，結(jié)果RSD值為1.31%（n=5），表明儀器精密度良好。（8）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣，按“2.2.4（1）”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積。結(jié)果RSD值為1.68%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。（9）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號溫?zé)崆蹇诜?份，按“2.2.4（3）”項下方法制備供試品溶液，依法測定，其平均含量為0.9178 mg/mL。結(jié)果綠原酸含量的RSD值為1.89%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。（10）樣品回收率試驗(yàn)。采用加樣回收法。精密量取同一供試品3組（共6份每份1mL），3組分別精密加入綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.06，2.45，3.31 mg，按上述色譜條件測定，計算回收率。綠原酸平均回收率為100.41%，RSD=1.78%（n=6）。（11）樣品含量測定。精密吸取樣品溶液10 μL，按上述色譜條件，依次進(jìn)樣測定。再按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下各對應(yīng)峰面積計算出各樣品組綠原酸的含量（見圖1）。水提正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

圖1　綠原酸含量測定HPLC色譜

2.2.5結(jié)果分析通過SPSS11.5軟件對表5中的綠原酸含量和浸膏得率兩指標(biāo)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6和表7。

從表5、表6中可以看出，因素A、因素B對綠原酸含量的影響有顯著性差異；因素C對綠原酸含量的影響無差異；影響因素大小順序?yàn)镽B＞RA＞RC，通過表5和表7可以看出，因素A和因素C對干膏率的影響有顯著性差異；因素B對干膏率的影響無差異；影響因素大小順序?yàn)镽C＞RA＞RB。綜合綠原酸含量及干膏率兩個考察指標(biāo)，確定最佳組合為A3B3C3，即加水量12倍，煎煮次數(shù)3次，煎煮時間50 min。

表5　水提正交試驗(yàn)結(jié)果

表6　水提正交試驗(yàn)綠原酸含量方差分析

表7　水提正交試驗(yàn)浸膏得率方差分析

2.2.6驗(yàn)證試驗(yàn)取處方量的藥材共3份，每份煎煮3次，加12倍量水；煎煮時間為50 min；提取后，每批藥液按“2.2.4（3）”項下方法制備出3個樣品，測定綠原酸含量和浸膏得率，結(jié)果見表8。表明優(yōu)選出的最佳工藝穩(wěn)定。

表8　3批樣品測定結(jié)果

2.3提取工藝優(yōu)化前后比較

2.3.1取處方量的藥材6份，各取3份藥材按照優(yōu)化后提取工藝及原提取工藝進(jìn)行提取，分別測定綠原酸含量、干膏率。優(yōu)化后提取工藝：柴胡、金銀花、薄荷、魚腥草和荊芥5味藥材粗粉在蒸餾4 h，料液比1∶8，超聲時間為60 min的條件下提取揮發(fā)油，提取揮發(fā)油后的藥渣與組方余藥進(jìn)行水提取。水提取條件為煎煮3次，加水倍數(shù)為12；煎煮時間為50 min。原提取工藝［2］：揮發(fā)油提取采用水蒸氣蒸餾法，蒸餾時間4 h，料液比1∶8；水提取條件為煎煮2次，加水倍數(shù)分別為10倍量、8倍量；煎藥時間為1.5 h、1 h。

2.3.2比較結(jié)果每批提取液選擇3個樣品測定綠原酸含量、干膏率和揮發(fā)油含量，測定結(jié)果取平均值，結(jié)果見表9，通過SPSS11.5軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。見表10。

表9　兩種工藝3批樣品測定結(jié)果比較

通過表10分析結(jié)果可知，優(yōu)化后工藝與原工藝綠原酸含量、干膏率以及揮發(fā)油含量均有顯著性差異（P＜0.01）。

表10　兩種提取工藝綠原酸含量、干膏率及揮發(fā)油含量的t檢驗(yàn)

3　討論

溫?zé)崆蹇诜悍街胁窈?、金銀花、薄荷、魚腥草和荊芥均含有揮發(fā)油成分，為防止提取過程中揮發(fā)油損失，增強(qiáng)揮發(fā)油類有效成分的藥效作用，故進(jìn)行原工藝的提取方法優(yōu)化，確定先進(jìn)行揮發(fā)油提取，藥渣與其他藥材合并水煎煮。揮發(fā)油提取試驗(yàn)中采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法［3］，利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，及強(qiáng)烈振動、高加速度、熱效應(yīng)、攪拌等超聲波的許多次級效應(yīng)，可以加速植物有效成分進(jìn)入溶劑，有利于樣品中有效成分轉(zhuǎn)移從而提高提取率［4］。因揮發(fā)油提取時油量不足1 mL，故以質(zhì)量進(jìn)行測定。

該制劑方中金銀花為臣藥，其主要活性成分為綠原酸，具有解熱抗炎、抗菌抗病毒，免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［5］，且該制劑中綠原酸含量測定的樣品處理簡單，雜質(zhì)峰少，色譜分離效果佳。故可選擇綠原酸為該提取工藝的指標(biāo)成分?？紤]到中藥復(fù)方制劑的協(xié)同作用，測定綠原酸含量的同時兼顧方中其他藥物有效成分的提取，所以將總固量也作為考察指標(biāo)，而原工藝沒有進(jìn)行綠原酸含量的檢測。中藥組成十分復(fù)雜，因此，該制劑提取工藝的合理性還有待于通過藥理實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

通過對優(yōu)化后提取工藝與原提取工藝的比較可知，在優(yōu)化后工藝下進(jìn)行試驗(yàn)中揮發(fā)油提取量，提取液中綠原酸含量及總固量均高于原提取工藝。優(yōu)化后的提取工藝提取效率高，穩(wěn)定、可靠，可為大生產(chǎn)提供依據(jù)。

［1］崔相烈，韓壽英.李鴻雕，等.小兒溫?zé)崆骞嗄c液的試制及臨床觀察［J］.黑龍江醫(yī)藥，2001，14（2）：136.

［2］高明，韓在虹，金福厚，等.溫?zé)崆蹇诜汗に嚄l件的篩選［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（10）50-51.

［3］黃蓓，毛長智.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計優(yōu)選荊芥穗揮發(fā)油超聲波提取工藝［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（20）：107-108.

［4］徐浩鋒，楊華俊，俞嵐.中藥有效成分現(xiàn)代提取技術(shù)研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2012，24（1）：13-18.

［5］孫立娟.金銀花的成分及藥理學(xué)研究［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2011，6（30）：239-240.

Extraction Technology Optimization for Wenreqing Oral Liquid by Orthogonal Test

SUN Wenpeng1，HAN Zaihong2，SUN Yu2，et al.

1 Medical College of Dalian University，Liaoning，Dalian 116622，China；2 Qiqihaer Hospital of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang Province，Heilongjiang，Qiqihaer 161005，China

Objective：To optimize extraction technology of Wenreqing Oral Liquid.Methods：The research had been screened out the best abstraction technological conditions of Wenreqing Oral Liquid by orthogonal test，using the weight of volatile oil to investigate the influence by the factors of distillation time，ratio of solid to liquid，ultrasonic time and so on.Chlorogentic acid content and extract yield rate were used as comprehensive indicators.Results：The optimization method of extraction technology of the volatile oil was distilling 4h with 8 times the amount of water and ultrasound for 1h.The best extracting process was decocting three times with 12 times the amount of water，and the three decocting durations were 50 minutes.Conclusion：The technology is reasonable and stable that can provide reference for industrial production.

Wenreqing Oral Liquid；Orthogonal test；Chlorogentic acid；Extraction technology

R283.6

A

1004-745X（2015）01-0059-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.020

黑龍江省齊齊哈爾市科技局計劃項目（SFGG-201344）

（電子郵箱：gm056@126.com）回流冷凝管連接。自冷凝管上端加入蒸餾水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，至水溢流入圓底燒瓶時為止。將燒瓶置于電熱套中加熱至沸騰，保持微沸，達(dá)到蒸餾時間后停止加熱，放置片刻，打開測定器下端的活塞，使水緩慢放出，水至油層上端到達(dá)0刻度線上5 mm處停止。放置1 h以上至揮發(fā)油凝固，取出，吸去固體表面的水分，精密稱重，計算揮發(fā)油含量，結(jié)果見表2。

2014-06-06）