南亞昀　李陽　雍學芳　王禮星　呂金捍

（寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，寧夏銀川750002）

·研究報告·

枸杞多糖對大鼠睪丸支持細胞體外增殖的影響*

南亞昀李陽雍學芳王禮星呂金捍△

（寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，寧夏銀川750002）

目的觀察枸杞多糖對體外培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細胞的增殖作用。方法選8～9 d齡的大鼠，采用兩步酶消化法獲取原代大鼠睪丸支持細胞，加入不同質量濃度的枸杞多糖，采用MTT比色法、直接細胞計數(shù)及CFSE熒光標記，檢測不同質量濃度枸杞多糖對體外培養(yǎng)別的睪丸支持細胞增殖的影響。結果與對照組相比，經(jīng)枸杞多糖處理后的睪丸支持細胞數(shù)量明顯增多，并呈劑量依賴性。結論枸杞多糖能夠促進大鼠睪丸支持細胞體外增殖。

枸杞多糖睪丸支持細胞體外細胞增殖

枸杞子性平、味甘，具有滋補肝腎、益精明目的功效，現(xiàn)代臨床廣泛用于抗衰老、降血糖、保肝及提高機體免疫等多個方面。枸杞多糖是枸杞主要成分之一，近年來對枸杞多糖的藥理作用進行了廣泛的研究，證實其具有免疫調節(jié)［1］、抗骨質疏松［2］、抗腫瘤［3］等功能。睪丸支持細胞（SCs）在曲細精管中，各級生精細胞鑲嵌在支持細胞上，SCs為生精細胞提供支架。同時，SCs能夠分泌類固醇類、激素類、調節(jié)蛋白類、生長因子類、旁分泌因子、轉運蛋白類等為生精細胞分化成熟提供穩(wěn)定的環(huán)境及必須的能量物質，保證精子正常有序的發(fā)生。因此，筆者研究了枸杞多糖對大鼠SCs體外增殖的影響，以期為枸杞多糖治療生殖障礙提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料CFSE（日本同仁化學研究所）、Trypsinase、Trypan blue（碧云天生物試劑有限公司）、MTT、CollagenaseⅣDimethyl sulfoxide（DMSO）、HEPES、BSA、Nitro Blue Tetrazolium（美國Sigma公司）、DMEM-F12 medium（Gibco Laboratories）、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（美國Hyclone公司）、枸杞多糖（西安華萃生物科技有限公司）。SPF級雄性8～9 d SD大鼠（由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供）。

1.2原代SCs的分離及培養(yǎng)用脫頸法處死大鼠后無菌收集雙側睪丸，將睪丸放入盛有預冷PBS的培養(yǎng)皿中，剝除脂肪墊、附睪及白膜，將睪丸組織機械剪碎后采用兩步酶消化法進行處理。將睪丸實質部分轉入盛有3 mL 0.25%胰酶的離心管內，在37℃孵箱中消化15～20 min，至生精小管分散呈云霧狀后終止消化，800×g離心5 min，D-hank’s液洗滌2次。在離心管中加入3倍于睪丸實質體積的CollagenaseⅣ（2 g/L），在37℃恒溫振蕩器中緩慢振蕩消化40 min，至生精小管呈糊狀后終止消化，向離心管中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基DMEM/F12，吹打消化液，使細胞充分分離，200目尼龍篩網(wǎng)過濾，800 g離心5 min，棄去上清，以D-hank’s液重懸細胞，再以800×g離心5 min洗滌2次，用DMEM/F12培養(yǎng)液接種至25 mL培養(yǎng)瓶。體外培養(yǎng)4 h后，小心傾斜培養(yǎng)皿，將未貼壁的精原細胞隨培養(yǎng)液一同吸去，加入含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)36～48 h，待Sertoli細胞伸出細胞突起，加入20 mmol/L Ttris-HCl低滲處理細胞3 min，用Hanks’s液清洗3次，加入DMEM/ F12完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3實驗分組空白對照組：細胞中只加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；給藥組：25μg/mL、50μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL共5組。

1.4MTT細胞計數(shù)原代培養(yǎng)的SCs接種到96孔板中，細胞密度調整為1.0×104/孔，無血清培養(yǎng)36 h，加入LBP，使其終質量濃度分別為25、50、100、200 μg/mL，對照組每孔只加無血清培養(yǎng)基，每孔液體量均為200μL，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，去上清加DMSO 150 μL/孔，充分振蕩10 min，待結晶充分溶解，用酶標儀測定支持細胞570 nm波長的OD值。

1.5直接細胞計數(shù)將細胞以密度4×104接種于48孔板，待細胞完全貼壁，按照上述實驗分組，每組加入相應質量濃度的藥物。36 h后終止培養(yǎng)，加入胰酶消化，充分吹打細胞，顯微鏡下觀察無細胞殘留在培養(yǎng)板內即可。細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣計數(shù)。細胞數(shù)計算公式：細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104。

1.6流式細胞術計數(shù)將細胞接種于6孔板中，每組設至少3個復孔。將細胞加入適量PBS洗1遍。加入胰酶于37℃孵箱消化，800 r/min離心5 min，加入無Ca2+和Mg2+的PBS洗1遍，棄去上清，加入1 mL無Ca2+和Mg2+的PBS或無血清培養(yǎng)液，重懸細胞，在細胞中加入濃度為5 μmol/L CFSE工作液，于37℃孵育10～30 min后，用40%體積的冷小牛血清立即終止標記5～10 min或加入含血清的培養(yǎng)基于冰上或4℃終止消化，800 r/min離心5 min，洗滌兩次后，加入上述藥物干預36 h，收取細胞至1.5 mL的EP管中，于激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長520 nm處流式細胞儀檢測熒光強度。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1MTT實驗結果見表1。由表1可以看出，隨著枸杞多糖劑量的增加，細胞的吸光度值相應的升高，說明SCs隨著枸杞多糖劑量的增加其增殖能力越強。當枸杞多糖質量濃度為25 μg/mL及50 μg/mL時，與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），當增加至100 μg/mL以上時，與對照組相比，細胞增殖明顯（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2直接細胞計數(shù)的結果見表2。表2顯示，枸杞多糖對SCs體外增殖的影響與MTT檢測結果一致，SCs的體外增殖枸杞多糖之間呈量效關系，隨著枸杞多糖劑量的增加（除了25 μg/mL及50 μg/mL組），枸杞多糖促進SCs增殖的作用更加明顯（P＜0.01）。

表1　MTT檢測枸杞多糖對SCs增殖影響的結果（±s）

表1　MTT檢測枸杞多糖對SCs增殖影響的結果（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別質量濃度（μg/mL）對照組0給藥組25 50吸光度值0.1868±0.0078 0.2104±0.0102 0.2552±0.0119 1000.0579±0.0579*2000.3424±0.0218**

表2　直接細胞計數(shù)檢測枸杞多糖對SCs增殖影響的結果（×104/mL，±s）

表2　直接細胞計數(shù)檢測枸杞多糖對SCs增殖影響的結果（×104/mL，±s）

組別質量濃度（μg/mL）對照組0給藥組25 50細胞數(shù)量7.3516±0.0809 8.2506±1.0101 10.7162±2.5781 10014.7972±1.2790**20016.5831±2.3140**

2.3流式細胞儀檢測結果見表3。隨著枸杞多糖劑量的增加，除了25 μg/mL及50 μg/mL組之外（P＞0.05），其余各組與對照組相比，SCs增殖更加明顯（P＜0.05或P＜0.01），枸杞多糖能夠顯著促進SCs的體外增殖，與MTT及直接細胞計數(shù)的結果一致，3種實驗方法互相補充，互相印證，更加證明了枸杞多糖促進SCs體外增殖的作用。

表3　流式檢測枸杞多糖劑量與SCs熒光強度關系的結果（±s）

表3　流式檢測枸杞多糖劑量與SCs熒光強度關系的結果（±s）

組別質量濃度（μg/mL）對照組0給藥組25 50熒光強度1471.32±132.91 1038.01±129.87 970.08±105.88 100586.61±87.42*200265.82±59.43**

3　討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖對雄性生殖系統(tǒng)具有保護作用。研究證實枸杞多糖能夠降低高溫所致的生精細胞損傷，并且枸杞多糖能提高半去勢大鼠的性功能，其作用機制不僅是提高抗氧化作用，而且通過調節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸的功能而實現(xiàn)的［4］。實驗證實枸杞多糖能抑制細胞色素C（Cyt C）自線粒體的釋放，從而使Caspase-3的活化減少，導致生精細胞的凋亡減少，推斷其通過線粒體途徑抑制生精細胞的凋亡而起到保護睪丸組織的作用［5］。在體外培養(yǎng)的精原干細胞培養(yǎng)液中單獨加入枸杞多糖后其增殖能力明顯增強［6］。

文獻報道，SCs在雄性小鼠出生后10 d不再增殖［7］，在雄性大鼠出生15 d后不再增殖［8］，在男性出生10歲之后停止增殖［9］，其數(shù)量處于恒定狀態(tài)。同時SCs的數(shù)量決定著精子的數(shù)量，其功能又決定著精子的質量，所以不難看出，SCs在男性生殖系統(tǒng)中重要的作用。SCs及其形態(tài)結構是1985年由Enrico Sertoli首次發(fā)現(xiàn)并報道的存在于生精上皮中的一種大細胞。在胚胎發(fā)育時期，SCs在睪丸的結構發(fā)育方面有重要的作用［10］。然而，在成年時期，SCs只用于支撐精子的發(fā)生。成熟的SCs為干細胞提供結構與營養(yǎng)支持、輔助它們的移動、提供輸精液及支持精子細胞的排放［11］。更重要的是一個SCs只能支持有限的干細胞數(shù)量，因此，最終成年睪丸的大小及精子數(shù)量與SCs的數(shù)量呈直接關系［12］。不僅在向生精上皮傳遞促性腺激素過程中發(fā)揮著不可取代的中樞作用，而且還具有分泌、營養(yǎng)、釋放、支持、免疫豁免及吞噬等多種功能［13-14］。

本實驗表明枸杞多糖能夠明顯促進大鼠SCs體外增殖，并且呈劑量依賴性，根據(jù)目前的實驗結果推斷其作用方式如下：（1）增加細胞營養(yǎng)。枸杞多糖含有微量元素、氨基酸及多種單糖，對體外培養(yǎng)的支持細胞進行營養(yǎng)供給；（2）抗氧化。枸杞多糖具有抗氧化的作用［15］，支持細胞在體外培養(yǎng)過程中可能會受到氧自由基的損傷，枸杞多糖可能通過清除細胞體外培養(yǎng)環(huán)境中的氧自由基，保持細胞的增殖能力；（3）抑制細胞凋亡，延緩細胞衰老。本實驗已明確枸杞多糖對體外培養(yǎng)的SCs的增殖作用，下一步將通過實驗證實其作用機制。

［1］董永杰，單鐵英，岳峰，等．枸杞多糖對淋巴細胞功能的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2010，19（19）：2362-2363.

［2］Ma Feng，Gao Jun，Wang Yi-nong，et al．Effects of serum containing Lycium barbarum polysaccharides on the intracellular Ca2+concentration and the expression of collagen typeⅠin MC3T3-E1 cells in vitro［J］．Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2012，16（20）：3733-3736．

［3］馬秀梓，孫潤廣，李佳媚，等．3種中藥多糖抗腫瘤作用的研究［J］.陜西師范大學學報，2012，40（6）77-80.

［4］羅瓊，黃曉蘭，李卓能，等．枸杞多糖對雄性大鼠性功能及生殖功能的影響［J］．營養(yǎng)學報，2006，28（1）：62-65.

［5］TAN Qiu-hui，AN Chang-xin，XIAO Yun，et al.Protective effect of lycium barbarum polysaccharides against heat stressinduced germ cell apoptosis in rats and its mechanism［J］．National Journal of Andrology Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi，2012，18（1）：88-92．

［6］Ma Liang-hong，Qiu Zhi-jun，Yan Sheng-nan，et al．Influence of lycium barbarum polysaccharides on proliferation of spermatogonial stem cells in vitro［J］．Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011，15（23）：4277-4281．

［7］劉紅云，張才喬.禽類下丘腦—垂體—性腺軸的內分泌調節(jié)［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42（9）：41-43．

［8］于利.大鼠睪丸的Sertoli細胞的分離純化及體外培養(yǎng)［J］.遼寧醫(yī)學院學報，2008，29（3）：204-205．

［9］Stefanio S，Morena AR，Petersen C，et al.A rapid method of sertoli cell isolation by DSA lectin，allowing mitotic analyses［J］.Mol Cellu Endocrinol，1998，146（1-2）：121-127．

［10］Brennan J，Capel B.One tissue，two fates：molecular genetic events that underlie testis versus ovary development［J］.Nat Rev Genet，2004，5，509-521.

［11］Jegou B.The Sertoli cell［J］.Baillieres Clin Endocrinol Metab，1992，6：273-311．

［12］Orth JM，Gunsalus GL，Lamperti AA.Evidence from Sertoli cell-depleted rats indicates that spermatid number in adults depends on numbers of Sertoli cells produced during perinatal development［J］.Endocrinology，1988，122：787-794．

［13］Touyz RM，Jianq L，Sairam MR．Follicle-stimulating hormone mediated calcium signaling by the alternatively spliced growth factor type l receptor［J］．Biol Reprod 2000，62（4）：1067-1074．

［14］Laslett AL，Li LH，Jester WF，et al.Thyroid hormone downregulates neural cell adhesion molecule expression and affects attachment of gonocytes in Sertoli cell-gonocyte cocultures［J］．Endocrinology，2000，141（5）：1633-1641．

［15］陳智松，吳志奎，陳玉英，等．枸杞多糖對衰老小鼠腦NO、NOS的影響［J］．中藥藥理與臨床，2000，16（6）：16-18.

Effect of Lycium Bararum Polysaccharides on Rat Sertoli cells in Vitro

NAN Yayun，LI Yang，YONGXuefang，et al.Ningxia People′s Hospital，Ningxia，Yinchuan 750002，China

Objective：To detect the effect of lycium bararum polysaccharides（LBP）on the proliferation of sertoli cells（SCs）cultured in vitro.Methods：Primary SCs were separated from 8～9 days male mice by two-step enzyme digestion method.SCs were cultured with LBP at different concentrations in vitro.The quantity of live cells was determined by MTT assay，direct cell counting and fluorescence intensity methods.Results：Compared with the control group，cell viability was significantly promoted after treatment with LBP and the percentage of cell survival in a dose dependent manner.Conclusion：LBP promoted SCs proliferation both in concentration-effect manner in vitro.

Lycium barbarum polysaccharides；Sertoli cells；Vitro；Proliferation

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0035-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.012

2014-10-08）

寧夏回族自治區(qū)自然科學基金資助項目（NZ13187）

（電子郵箱：lvjhan_2014@yeah.com）