沈瓊　朱琰　朱旭瑩

（上海市中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海200335）

·研究報告·

三七總皂苷早期使用對腦出血大鼠炎性反應影響的基礎研究*

沈瓊朱琰朱旭瑩

（上海市中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海200335）

目的觀察研究早期使用三七總皂苷對腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損狀況以及炎性反應遞質的影響。方法將雄性SD大鼠隨機分成假手術組、模型組、三七總皂苷組，采用膠原酶注射尾狀核法制作腦出血模型，觀察大鼠腦出血死亡率、神經(jīng)功能缺損情況以及血腫周圍白介素（IL）-6和基質金屬蛋白酶（MMP）-9的表達水平。結果3組大鼠在造模的過程中，均有死亡病例發(fā)生。其中，假手術組腦出血死亡率（腦出血死亡數(shù)/總死亡數(shù)）低于模型組和三七總皂苷組（均P＜0.05），而模型組和三七總皂苷組腦出血死亡率差異不大（P＞0.05）。術后24 h和術后第7日，模型組和三七總皂苷組的神經(jīng)功能缺損評分均高于假手術組（P＜0.05）。術后24 h比較，模型組和三七總皂苷組神經(jīng)功能缺損評分無明顯差異（P＞0.05）。術后第7日比較，三七總皂苷組的神經(jīng)功能評分及其降低的分值均明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05）。術后48 h，模型組以及三七總皂苷組血腫周圍的IL-6和MMP-9的積分光密度均明顯高于假手術組（均P＜0.05）。而模型組與三七總皂苷組比較，血腫周圍的IL-6和MMP-9的積分光密度差別不大（均P＞0.05）。術后第7日，IL-6、MMP-9的積分光密度模型組與三七總皂苷組明顯高于假手術組（均P＜0.05），且三七總皂苷組的積分光密度均低于模型組（均P＜0.05）。3組在術后第7日時，IL-6的表達均較48 h增高（均P＜0.05），其中模型組升高最明顯，三七總皂苷組和假手術升高都相對較緩；假手術組和三七總皂苷組在術后第7日時MMP-9的表達均較48 h降低（均P＜0.05），而模型組較前升高（P＜0.05）。結論三七總皂苷可以減輕大鼠神經(jīng)功能缺損，抑制炎性因子IL-6、MMP-9的釋放，且用藥安全。

腦出血大鼠炎性反應三七總皂苷

腦出血（ICH）是一種常見危重疾病，其發(fā)病急，致殘率和死亡率高，需要緊急及時救治，目前臨床上尚缺乏針對性強且十分有效的治療，因此探索腦出血的發(fā)病機制和新的治療方法一直是醫(yī)學研究熱點之一。近年來研究表明，腦出血的血腫周圍普遍存在炎癥反應，其在腦出血的繼發(fā)性損傷中有著非常重要的意義，而在非出血性腦損傷中則無明顯意義。中藥三七中最重要的活性成分是皂苷［1-2］，其對腦缺血以及腦出血后遺癥有確切臨床療效，可以明顯減輕腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)元損害［3］，明顯保護腦神經(jīng)。本實驗研究早期使用三七總皂苷對腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損狀況以及炎性反應遞質的影響，為在臨床上治療腦出血提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組選取48只健康清潔級雄性SD大鼠體質量（285±25）g，隨機分成假手術組、模型組、三七總皂苷組，每組16只。

1.2造模與給藥模型組、三七總皂苷組大鼠10%水合氯醛（0.4 mg/kg）行腹腔麻醉，消毒頭背部皮膚，切開頭部正中的皮膚，以暴露顱骨，依據(jù)《腦立體定位圖譜》來確定右側的尾狀核作為注射點坐標：前囟前0.1 mm，矢狀縫向右旁開4.0 mm，向下垂直進針5.5 mm。將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，以固定于立體定位儀上的微量進樣器，在2 min左右緩慢地注入1 μLⅦ型膠原酶（含有膠原酶1U），留針7 min，緩慢拔針，用少量的慶大霉素防止感染，縫合切口。假手術組大鼠僅注入同等量生理鹽水，其余手術過程同上。造模成功后，三七總皂苷組給予三七總皂苷注射液（商品名血栓通，由廣西梧州制藥股份有限公司生產）72 mg/kg（10mg/mL），模型組和假手術組給予生理鹽水7.2mL/kg，每日1次，共7 d。

1.3觀察指標（1）動物行為測試：分別在術后24 h、第7日對各組大鼠進行行為、神經(jīng)體征觀察，神經(jīng)功能缺損評分按照Zea Longa神經(jīng)功能標準進行，0分：無任何神經(jīng)功能缺損癥狀。1分：對側的前爪或者是后爪不能完全地伸展。2分：若大鼠在行走的時候，向手術對側轉圈。3分：若大鼠在行走的時候，身體向手術對側傾倒。4分：自己不能行走，并且意識喪失。（2）免疫組化檢測：采用SP法檢測白介素（IL）-6、基質金屬蛋白酶（MMP）-9。

1.4統(tǒng)計學處理應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1　3組大鼠死亡率的比較（%）

2　結果

2.13組大鼠死亡率比較見表1。3組大鼠在造模的過程中，均有死亡病例發(fā)生，通過對其腦組織進行解剖，觀察是否有血腫，可以把死亡原因分成腦出血死亡和非腦出血死亡兩種。其中，假手術組腦出血死亡率（腦出血死亡數(shù)/總死亡數(shù)）為0，明顯低于模型組和三七總皂苷組（均P＜0.05），而模型組和三七總皂苷組腦出血死亡率差別不大（P＞0.05）。

2.23組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較見表2。術后24 h和術后第7日，模型組和三七總皂苷組的神經(jīng)功能缺損評分均高于假手術組（P＜0.05）。術后24 h比較，模型組和三七總皂苷組神經(jīng)功能缺損評分無明顯差異（P＞0.05）。術后第7日比較，三七總皂苷組的神經(jīng)功能評分明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05）。

表2　3組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

表2　3組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

與假手術組同期比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，△P＜0.05。下同。

組別n降低分值術后24 h術后第7日假手術組150模型組120.02±0.54*0 0 2.34±0.97*2.19±0.61*三七總皂苷組111.30±0.57*△2.57±0.86*1.25±0.54*△

2.33組大鼠IL-6、MMP-9免疫組織化學染色比較見表3。術后48 h，模型組以及三七總皂苷組血腫周圍的IL-6和MMP-9的積分光密度均明顯高于假手術組（均P＜0.05），而模型組與三七總皂苷組比較，血腫周圍的IL-6和MMP-9的積分光密度差別不大（均P＞0.05）。術后第7日，IL-6、MMP-9的積分光密度模型組與三七總皂苷組明顯高于假手術組（均P＜0.05），且三七總皂苷組的積分光密度均低于模型組（均P＜0.05）。3組在術后第7日時，IL-6的表達均較48 h增高（均P＜0.05），其中模型組升高最明顯，三七總皂苷組和假手術升高都相對較緩；假手術組和三七總皂苷組在術后第7日時MMP-9的表達均較48 h降低（均P＜0.05），而模型組較前升高（P＜0.05）。

表3　3組大鼠IL-6及MMP-9免疫組織化學染色比較（±s）

表3　3組大鼠IL-6及MMP-9免疫組織化學染色比較（±s）

與本組術后48 h比較，#P＜0.05。

組別時間IL-6MMP-9假手術組術后48 h132.5±80.62247.9±127.34（n=15）術后第7日477.1±224.90#197.5±127.66#模型組術后48 h435.1±105.43*526.7±193.29*（n=12）術后第7日1218.2±378.35*#820.3±382.21*#三七總皂苷組術后48 h452.3±116.76*554.4±204.25*（n=11）術后第7日736.2±184.68*△#472.8±220.17*△#

3　討論

腦出血可屬于中醫(yī)學“腦卒中”范疇，急性期其以邪熱、內風、痰濁、瘀血為主，最終導致腦絡閉阻，血行不暢而成瘀，其本質為肝腎陰虛、氣血虛弱。腦出血導致的血腫及周圍水腫、血液循環(huán)障礙，與中醫(yī)的瘀血是相同的，氣血運行不暢，腦失所養(yǎng)。在臨床治療上應該行氣活血化瘀散結，解除血腫壓迫為主［4］。

腦出血可導致血腫周圍區(qū)出現(xiàn)繼發(fā)性的神經(jīng)元凋亡［5］，楊云芳等對腦出血后的細胞凋亡進行了研究，認為其與缺氧誘導因子表達有關［6］。另外，腦組織損傷后在受損區(qū)域內有大量細胞因子表達以及炎性細胞的浸潤，同時，炎性因子過度表達又可加重腦組織損傷。腦出血缺血發(fā)生后，血漿及腦組織的TNF-α、IL-6、MMP-9等的含量均出現(xiàn)變化，并且隨著時間的變化而變化。

近年來研究表明，三七總皂苷具有抗血栓、抗炎、清除自由基、阻斷鈣通道、保護神經(jīng)、抑制神經(jīng)細胞的凋亡、改善微循環(huán)等作用［7］，三七總皂苷可以促進腦出血后神經(jīng)功能缺損的恢復，抑制炎性反應遞質的表達，一定程度下調TNF-α、IL-6、MMP-9［8］，在不同時間給予急性期腦出血大鼠三七治療可以抑制血腫周圍區(qū)的神經(jīng)細胞凋亡，最終能夠減輕急性期腦水腫，減少血腫體積［9］。同時，三七總皂苷還能降低腦出血患者血漿中的MMP-9的表達，從而抑制腦水腫的形成，減輕腦神經(jīng)的損傷［10］。

本研究結果示，大鼠在發(fā)生腦出血以后，炎癥反應迅速激活，短時間內（本實驗48 h）炎性介質IL-6以及MMP-9迅速升高，可持續(xù)上升至造模第7日。而三七總皂苷之所以能夠改善神經(jīng)功能的缺損狀況，可能是通過抑制炎癥介質釋放，減少各種炎性細胞游走與浸潤，從而降低血腦屏障的通透性。綜上所述，三七總皂苷作為中藥三七的重要活血成分，具有很好的化瘀作用，其可以保護腦髓，促進神機恢復，安全性良好，可以在腦出血早期應用。

［1］李彥，陳文超，李炳.三七皂苷Rb1對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬組織血紅素加氧酶-1表達的影響［J］.實用兒科臨床雜志，2010，25（18）：1422-1424.

［2］唐映紅，黃小平，譚華，等.三七總皂苷對腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡及凋亡線粒體途徑和c-Jun氨基末端激酶表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，16（16）：129-136.

［3］張建平，司銀楚，朱培純.三七總皂苷促進腦出血后腦內神經(jīng)元的存活及損傷修復［J］.中成藥，2010，32（5）：844.

［4］王恰如，王雷芳，沈海.三七總皂甙與參麥注射液對大鼠腦出血后腦水腫、行為學變化的影響［J］.中國老年學雜志，2011，31：289.

［5］劉海洋，孫征，王登科，等.黃芪聯(lián)合丹參注射液對大鼠腦出血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡抑制作用的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（8）：1892.

［6］楊云芳，白雪，江云東，等.蛭龍活血通淤膠囊對腦出血大鼠神經(jīng)細胞凋亡與缺氧誘導因子-1α蛋白表達的作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（4）：964.

［7］楊挺，蔣贊利，茅祖斌.血塞通在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用［J］.現(xiàn)代醫(yī)學，2010，38（1）：86.

［8］趙雪松，陳志剛，徐枝芳，等.早期使用三七總皂苷對大鼠腦出血炎性反應的影響［J］.世界中醫(yī)藥，2013，8（7）：789.

［9］陳曉鋒，宋孝光.急性期腦出血大鼠不同時間內給予三七治療的作用對比研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（3）：586.

［10］王薇.三七總皂苷對腦出血患者血腫吸收及血漿基質金屬蛋白酶-9的影響［J］.中草藥，2011，42（5）：963-965.

Early Application of Total Saponins of Panax in Rats with Cerebral Hemorrhage

SHEN Qiong，ZHU Yan，ZHU Xuying.Shanghai Shuguang Hospital Affiliated with Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200335，China

Objective：To observe the PNS on improving neurological deficit and the effects of inflammatory mediators in rat brain hemorrhage and to provide a theoretical basis for the early application of cerebral hemorrhage. Methods：Male SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，the group of PNS.Collagenase injections caudate nucleus produced cerebral hemorrhage model was bleeding mortality，neurological deficit，the hematoma around the rat brain expression of IL-6 and MMP-9.Results：In the first seven days after the PNS group of neurological score，lower scores were better than those in the untreated group，and the mortality associated with cerebral hemorrhage model group equal.Modeling，48 hours and 7 days，the model group PNS group perihematomal IL-6，integrated optical density of MMP-9 were significantly were higher significantly than those in the sham group（P＜0.05）.Modeling 7 days later，the group of PNS integral optical density was lower remarkably than that in the model group（P＜0.05）.Conclusion：PNS can reduce neurological deficits and inhibit IL-6，MM-9 release.

Intracerebral hemorrhage in rats；Inflammatory response；PNS

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0033-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.011

2014-11-01）

上海市教委科研課題（szy10094）