厲飛　裘濤　胡婭娜　陶水良

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006；3.浙江省金華市中醫(yī)院，浙江金華321017；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053）

·研究報(bào)告·

郁金提取物對(duì)CCI模型大鼠痛覺(jué)行為及BDNF表達(dá)的影響*

厲飛1裘濤2胡婭娜3陶水良4△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006；3.浙江省金華市中醫(yī)院，浙江金華321017；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053）

目的探討郁金提取物對(duì)神經(jīng)病理性疼痛模型（CCI）大鼠痛覺(jué)行為及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)的影響。方法建立CCI大鼠模型，將SD大鼠分為正常組、模型組、郁金提取物低、中、高劑量組，加巴噴汀組和溶劑組，對(duì)各組大鼠進(jìn)行機(jī)械縮足閾值（PMWT）測(cè)定，用ELISA法測(cè)定大鼠血清中BDNF的表達(dá)。結(jié)果（1）與正常組相比，造模后大鼠PMWT顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明神經(jīng)病理性模型造模成功；與溶劑組相比，郁金提取物高劑量組和加巴噴汀組顯著上調(diào)CCI模型大鼠PMWT（P＜0.05）。（2）造模后大鼠血液內(nèi)BDNF表達(dá)均較正常組顯著增加（P＜0.05）；與溶劑組相比，郁金提取物中、高劑量組和加巴噴汀組能顯著降低血液中BDNF的表達(dá)（P＜0.05）。郁金提取物高劑量組、加巴噴汀組和正常組BDNF表達(dá)無(wú)顯著差異。結(jié)論郁金提取物可能通過(guò)降低CCI模型大鼠血清BDNF的表達(dá)而發(fā)揮抗神經(jīng)病理性疼痛的作用。

郁金提取物神經(jīng)病理性疼痛BDNF

神經(jīng)病理性疼痛（NP）是一種由于損傷或疾病侵襲到中樞神經(jīng)系統(tǒng)或軀體感覺(jué)系統(tǒng)后引起的慢性疼痛。如帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)病變、幻肢痛和殘肢痛等?；颊叱Ｓ凶园l(fā)性疼痛、觸誘發(fā)痛、痛覺(jué)過(guò)敏等癥，亦可伴有焦慮、抑郁等精神癥狀，目前針對(duì)NP的發(fā)病機(jī)制尚未明確，傳統(tǒng)用藥療效不佳［1-2］。越來(lái)越多的研究顯示脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中具有重要作用［3］，當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞上的離子型嘌呤受體P2X4大量表達(dá)，通過(guò)鈣離子和p38 MAPK的激活引起腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）釋放，最終導(dǎo)致NP［4-5］。本文將進(jìn)一步探討郁金提取物對(duì)大鼠神經(jīng)功能及BDNF表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)健康雄性清潔級(jí)SD大鼠36只，體質(zhì)量250～294 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。保證12 h明暗交替光照，自由飲食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、郁金提取物低、中、高組、加巴噴汀組、溶劑組，每組4只。

1.2藥物郁金提取物（含β-欖香烯＞80.0%）：浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院谷滿倉(cāng)老師提供［6］；加巴噴丁：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030662；無(wú)水乙醇：永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司，批號(hào)20130921；DMSO：美國(guó)AMRESCO公司；Tween-80：北京索萊寶科技有限公司；10%水合氯醛：浙江省中醫(yī)院自制。

1.3儀器與試劑電子天平：奧豪斯中國(guó)地區(qū)；機(jī)械測(cè)痛儀：Ugo Basil Biological Research Apparatus，Comerio（va）Italy；大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子ELISA檢測(cè)試劑盒（CK-E30666R）。

1.4模型制備根據(jù)Bennettt-Xie建立CCI模型［7］，大鼠禁食12 h后，予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，消毒大鼠的右下肢，備皮后于股后暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)主干，在接近其分叉之前用4根320的鉻制羊腸線間隔1 mm進(jìn)行松結(jié)扎，要求不阻斷神經(jīng)血供，然后逐層縫合切口。術(shù)后每只予青霉素4萬(wàn)U腹腔注射（80萬(wàn)U青霉素溶于2 mL 0.9%氯化鈉注射液），連用3 d抗感染。術(shù)畢后將大鼠放入底部鋪有軟鋸屑?jí)|料的塑料盒中，予安靜、溫暖、避強(qiáng)光環(huán)境自由喂養(yǎng)。

1.5給藥方法造模后，郁金提取物低、中、高劑量組分別給予郁金提取物60、120、180 mg/kg［8］，加巴噴丁組給予加巴噴丁100 mg/kg，溶劑組給予溶劑，其配置方法為DMSO1.5g與無(wú)水乙醇1.5g混合均勻后加Tween-80 4.5 g充分溶解，臨用前用純凈水稀釋至45 mL。用藥各組在造模后第1日起按各組藥物0.2 mL/100 mg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥14 d。正常組和模型組造模后均予正常喂養(yǎng)，不予任何藥物干預(yù)。

1.6機(jī)械縮足閾值（PMWT）測(cè)定正常組、模型組于術(shù)后第3、7、14日，各給藥組在給藥第14日測(cè)定，測(cè)定時(shí)間為8：00～14：00。大鼠于機(jī)械測(cè)痛儀的有機(jī)玻璃箱中（22 cm×12 cm×22 cm），底為0.5 cm×0.5 cm孔徑的鐵絲網(wǎng)，實(shí)驗(yàn)之前適應(yīng)15 min，以不同折力的Von Frey細(xì)絲垂直刺激大鼠右足足底，觀察縮足反應(yīng)，大鼠在折力達(dá)到一定值時(shí)，足底移開(kāi)Von Frey針出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，此時(shí)的折力記錄為PMWT，每只大鼠每次測(cè)量5次，每次測(cè)量間隔5 min，最大值為50 g，去掉1個(gè)最高值及1個(gè)最低值，取平均值即為其PMWT。

1.7ELISA分析正常組、模型組于術(shù)后第3、7、14日，各給藥組在給藥第14日予10%水合氯醛（0.3 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，按步驟進(jìn)行ELISA分析BDNF含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。各組用重復(fù)測(cè)量或單因素方差分析，多重比較采用LSD（方差齊時(shí)）或Tamhane’s T2（方差不齊時(shí)）法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠機(jī)械痛行為學(xué)比較見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，造模后大鼠PMWT值均顯著降低（P＜0.01），提示造模成功，且隨著造模后時(shí)間增加PMWT值呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明造模14 d內(nèi)機(jī)械痛域進(jìn)行性降低；與模型組、郁金提取物低劑量組、郁金提取物中劑量組、溶劑組比較，郁金提取物高劑量組和加巴噴丁組PMWT值顯著增高（P＜0.05）。

表1　各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)比較（g，±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與郁金提取物高劑量組、加巴噴丁組比較，△P＜0.05。下同。

組別n正常組4模型組4郁金提取物低劑量組4機(jī)械縮足閾值33.33±3.21 12.35±1.78*13.53±2.62△郁金提取物中劑量組413.69±2.60△郁金提取物高劑量組419.11±2.55加巴噴丁組415.63±4.69溶劑組413.01±1.78△

2.2郁金提取物對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型血清BDNF表達(dá)的影響見(jiàn)表2。與正常組相比，造模后大鼠血液內(nèi)BDNF表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。與溶劑組相比，郁金提取物中、高劑量組和加巴噴丁組能顯著降低血液中BDNF的表達(dá)（P＜0.05）。郁金提取物高劑量組、加巴噴丁組和正常組比較BDNF表達(dá)無(wú)顯著差異。

表2　各組大鼠血液BDNF表達(dá)比較（pg/mL，±s）

表2　各組大鼠血液BDNF表達(dá)比較（pg/mL，±s）

與溶劑組比較，▲P＜0.05。下同。

組別n正常組4模型組4郁金提取物低劑量組4 BDNF 358.53±37.37 634.78±67.53*520.75±27.57*郁金提取物中劑量組4449.28±22.00*▲郁金提取物高劑量組4412.33±26.15▲加巴噴丁組4391.46±36.75▲溶劑組4468.55±26.41*

3　討論

慢性神經(jīng)結(jié)扎性損傷（CCI）是目前使用最廣泛的神經(jīng)病理性疼痛模型之一，其通過(guò)結(jié)扎坐骨神經(jīng)來(lái)模擬神經(jīng)病理性疼痛的癥狀，具有高度的重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)建模后出現(xiàn)大鼠右側(cè)后足舔爪、跛行，安靜狀態(tài)下足趾并攏并保持防御姿勢(shì)等現(xiàn)象，以上均提示建模成功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CCI組大鼠術(shù)后各觀察點(diǎn)PMWT值較正常組均顯著降低，提示坐骨神經(jīng)結(jié)扎后大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。與模型組，郁金提取物低、中劑量組，溶劑組相比，郁金提取物高劑量及加巴噴丁組大鼠PMWT值明顯升高，提示兩者均具有一定的鎮(zhèn)痛作用。

BDNF是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)元的生成、分化中有著重要的作用，同時(shí)也是神經(jīng)活動(dòng)和突觸可塑性的重要調(diào)節(jié)因子［9］，近年來(lái)研究顯示其在神經(jīng)病理性疼痛方面也具有重要意義［10］。外周或中樞神經(jīng)損傷后，在CCL2［11］、CCL21［12］及INF-γ等的作用下，小膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X4受體大量表達(dá)，通過(guò)鈣離子內(nèi)流和p38 MAPK的活化引起B(yǎng)DNF、細(xì)胞因子和炎癥趨化因子等大量釋放，BDNF既可以作用于神經(jīng)元，增強(qiáng)突觸前初級(jí)傳入神經(jīng)末梢傷害性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及突觸后痛覺(jué)傳遞神經(jīng)元的敏感性和反應(yīng)性，亦可進(jìn)一步活化膠質(zhì)細(xì)胞釋放更加多的細(xì)胞因子，形成正反饋效應(yīng)，從而引發(fā)持續(xù)性的神經(jīng)病理性疼痛。Ferrini F等［13］通過(guò)研究顯示，產(chǎn)生于小膠質(zhì)細(xì)胞的BDNF通過(guò)與神經(jīng)元TrkB的結(jié)合影響K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的（KCC2）功能，從而降低神經(jīng)細(xì)胞中的Cl-濃度，最終減弱GABAAR/GlyR的抑制作用，導(dǎo)致觸誘發(fā)痛等神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，造模后第3、7、14日大鼠血液內(nèi)BDNF表達(dá)均顯著增加（P＜0.01），說(shuō)明坐骨神經(jīng)損傷可導(dǎo)致BDNF大量釋放。與溶劑組相比，郁金提取物組和加巴噴汀組能顯著降低血液中BDNF的表達(dá)（P＜0.05），并且提高大鼠的機(jī)械縮足閾值，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示正常組、郁金提取物高劑量組和加巴噴汀組大鼠血液中BDNF表達(dá)無(wú)顯著差異，說(shuō)明郁金提取物可能通過(guò)調(diào)節(jié)CCI模型大鼠血清BDNF至正常水平而達(dá)到抗神經(jīng)病理性疼痛的作用。Chen HS等［14］也通過(guò)研究顯示，鞘內(nèi)注射BDNF抗體能顯著改善脊神經(jīng)前根橫斷導(dǎo)致的機(jī)械痛超敏，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。而Constandil L等［15］研究提示鞘內(nèi)注射0.003 ng的BDNF就能顯著降低正常小鼠的疼痛閾值，但不呈劑量依賴(lài)性，即隨著B(niǎo)DNF注射劑量的增加，疼痛閾值下降程度及疼痛持續(xù)時(shí)間并不相應(yīng)增加。綜上所述，本研究通過(guò)觀察郁金提取物對(duì)CCI疼痛模型中大鼠PMWT閾值和BDNF表達(dá)的影響，證實(shí)郁金提取物可以抑制CCI模型大鼠BDNF的釋放，提高PMWT閾值，從而緩解神經(jīng)病理性疼痛，為臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新的靶點(diǎn)。

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Effect of Turmeric Extraction in Attenuation of Pain Behavior and BDNF Expression with CCI Rats

LI Fei1，QIU Tao2；HU Yana3，et al.1 Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China；2 The First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310006，China；3 Jinhua Hospital of TCM，Zhejiang Province，Zhejiang，Jinhua 321017，China

Objective：To investigate the effect of turmeric extraction on pain behavior and the BDNF expression in neuropathic pain model（CCI）rats.Methods：36 SD rats were divided into normal group，model group，turmeric extract low，medium and high dose groups，gabapentin group and solvent group.Each rat was tested with PMWT，and BDNF expression in rats'serums were detected by ELISA.Results：（1）Compared with the normal group，the thresholds of PMWT were significantly decreased after the establishment of CCI model（P＜0.05），which indicated the successful establishment of CCI rats model.Compared with the solvent group，PMWT thresholds were significantly upregulated in turmeric extract high dose group and gabapentin group（P＜0.05）.（2）Compared with the normal group，BDNF expression were extraordinarily increased after the establishment of CCI model（P＜0.05）.Compared with the solvent group，the expressions of BDNF in serum in turmeric extract medium，high dose group and gabapentin group were significantly reduced（P＜0.05）.Turmeric extraction high-dose group，gabapentin group and the normal group had no significant difference in BDNF expression.Conclusion：Turmeric extraction can attenuation neuropathic pain by reducing serum BDNF expression in CCI rat model.

Turmeric extraction；Neuropathic pain；BDNF

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0030-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.010

2014-10-14）

浙江省中醫(yī)藥管理局科研課題（2013ZB031）

（電子郵箱：lanethtao@163.com）