韓云　謝東平　賴芳　楊衛(wèi)立　林熙泉

（廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院，廣東廣州510145）

·研究報(bào)告·

四逆湯對膿毒癥中晚期大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用*

韓云謝東平賴芳楊衛(wèi)立林熙泉

（廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院，廣東廣州510145）

目的觀察四逆湯對膿毒癥中晚期大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。方法雄性SPF級大鼠70只，隨機(jī)分為正常對照組、膿毒癥模型組、四逆湯低劑量組和高劑量組。采用盲腸結(jié)扎穿孔制作膿毒癥中晚期大鼠模型。治療組在造模后72 h進(jìn)行干預(yù)，觀察各組大鼠造模后第7日存活率，對存活大鼠進(jìn)行腹主動脈取血，測定血清TNF-α、IL-10及cTnT水平，處死大鼠后采集心肌組織，應(yīng)用TUNEL法進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測。結(jié)果經(jīng)四逆湯干預(yù)治療后，模型組與四逆湯高、低劑量治療組第7日存活率差異無顯著意義（P＞0.05），但治療組大鼠血清TNF-α、IL-10及cTnT較正常對照組出現(xiàn)不同程度下降。四逆湯高、低劑量治療組心肌細(xì)胞凋亡率較模型組明顯下降（P＜0.05），但高劑量組與低劑量組之間心肌細(xì)胞凋亡率無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論四逆湯可減輕心肌細(xì)胞損傷，延緩心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與改善膿毒癥晚期大鼠免疫功能狀態(tài)，抑制炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)。

膿毒癥心肌功能障礙心肌凋亡四逆湯

膿毒癥性心肌功能障礙（SIMD）是膿毒癥性休克持續(xù)難以糾正，并導(dǎo)致患者最終死亡的重要原因［1］。目前對于膿毒癥性心肌功能障礙機(jī)制尚未完全明確，國外研究顯示膿毒癥能誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡，早期（1～3 d）即開始出現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷，而且該效應(yīng)在膿毒癥中、晚期（3～7 d）更加明顯，其機(jī)制可能與腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥介質(zhì)啟動內(nèi)、外源性細(xì)胞凋亡通路有關(guān)［2］。四逆湯是中醫(yī)治療陽氣外脫證的代表方，具有強(qiáng)心、抗休克、改善心肌缺血等多種藥理作用，既往的研究發(fā)現(xiàn)四逆湯能夠有效改善缺血再灌注引起的心肌凋亡，抑制內(nèi)毒素引起的炎癥介質(zhì)過度釋放［3-5］。本研究擬建立SIMD大鼠模型，觀察四逆湯對SIMD大鼠模型的影響，并重點(diǎn)從炎癥介質(zhì)、心肌凋亡角度探討其可能的細(xì)胞分子機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)四逆湯，應(yīng)用四逆湯類方干預(yù)膿毒癥性休克、SIMD提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與試劑SPF級SD雄性大鼠70只，體質(zhì)量（350±30）g，由廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號為0068998和0072254。四逆湯煎劑由熟附子、干姜、炙甘草按照3∶2∶2的比例濃煎成含原生藥1 g/mL，過濾除菌分裝-20℃保存?zhèn)溆?。主要試劑：大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（武漢博士德公司，產(chǎn)品編號：EK0418）；大鼠白介素10（IL-10）ELISA檢測試劑盒（武漢華美公司，產(chǎn)品編號：CSB-E07972r）；大鼠心肌肌鈣蛋白T（CTnT）ELISA檢測試劑盒（武漢華美公司，產(chǎn)品編號：CSB-E11305r）；TUNEL試劑盒：（In Situ Cell Death Detection Kit，POD（Cat.No.11684817910，ROCHE公司）。

1.2分組與給藥按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動物分為4組：正常對照組）、膿毒癥模型組、四逆湯低劑量治療組、四逆湯高劑量治療組。正?？瞻捉M10只，其余每組20只。四逆湯組自造模72 h后開始給藥干預(yù)，低劑量組按原生藥3 g/d予四逆湯灌胃；高劑量組則按原生藥6 g/d給藥。正常對照組及模型組則每日灌服3 mL生理鹽水。

1.3模型制備參考文獻(xiàn)［6］采用CLP造模。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周，術(shù)前禁食12 h；以10%水合氯醛（0.3 mL/ 100 g）經(jīng)腹腔注射麻醉后，沿腹前正中線切開2 cm，游離腸系膜和盲腸，以3-1絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，結(jié)扎完畢保證腸道通暢后，在盲腸腸壁上穿刺2下，造成2個(gè)瘺口，輕輕擠壓腸管使糞便自穿刺口溢出，還納腸管，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)畢腹壁皮下注射生理鹽水3 mL/ 100 g。術(shù)后自由進(jìn)水進(jìn)食。

1.4標(biāo)本采集及檢測造模后第7日對所有存活大鼠予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，按照cTnT、TNF-α以及IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書方法對以上指標(biāo)進(jìn)行檢測；處死大鼠后采集左心室心肌組織，按照TUNEL試劑盒說明書方法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1生存分析模型組第7日存活大鼠6只，存活率為30%；四逆湯低劑量組第7日存活大鼠10只，存活率為50%；四逆湯高劑量組第7日存活大鼠11只，存活率為55%。四逆湯兩組分別與模型組比較，存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A、B兩組間比較，各組大鼠存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2四逆湯對膿毒癥中晚期大鼠血cTnT、TNF-α、IL-10水平的影響見表1。模型組，四逆湯高、低劑量組大鼠血清cTnT、TNF-α、IL-10明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，四逆湯組大鼠血cTnT、TNF-α、IL-10水平有明顯下降（P＜0.05），但四逆湯兩組間cTnT、TNF-α、IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組大鼠血清cTnT、TNF-α和IL-10水平比較（pg/mL，±s）

表1　各組大鼠血清cTnT、TNF-α和IL-10水平比較（pg/mL，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別nIL-10 cTnTTNF-α正常對照組10153.5±59.58模型組6707.17±94.41*四逆湯高劑量組10267.5±76.41*△722.27±426.66652.68±208.35 4678.05±1391.71*2080.79±338.75*1397.48±519.78*△1053.85±191.32*△四逆湯低劑量組11251.66±101.31*△1161.17±393.74*△997.51±205.40*△

2.3四逆湯對膿毒癥中晚期大鼠心肌凋亡的影響見表2和圖1。模型組、四逆湯兩組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組（P＜0.05）；經(jīng)四逆湯干預(yù)后，四逆湯兩組心肌細(xì)胞凋亡率較模型組有明顯下降（P＜0.05），但四逆湯兩組間心肌細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（%）

圖1　TUNEL檢測膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡（400倍）

3　討論

膿毒癥性休克發(fā)展迅速，預(yù)后極差，而膿毒癥性心肌功能障礙是導(dǎo)致膿毒癥性休克患者死亡的重要原因［1］。國外研究指出膿毒癥大鼠普遍存在心肌功能障礙的情況，尤其是晚期膿毒癥大鼠心肌功能障礙更加明顯［7］。國內(nèi)學(xué)者研究指出膿毒癥大鼠早期開始出現(xiàn)心肌損傷，到72 h左右心肌損害標(biāo)志物水平達(dá)到高峰［8］。以上文獻(xiàn)結(jié)果均提示心肌細(xì)胞的凋亡有可能是膿毒癥大鼠中、晚期出現(xiàn)心肌功能障礙的重要原因。故本研究采用中、晚期（3～7 d）作為干預(yù)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行療效評價(jià)。

CLP方法為復(fù)制膿毒癥模型的經(jīng)典方法。本研究所制備CLP模型各組3天死亡率均接近50%，與文獻(xiàn)［7］所顯示死亡率相接近，且目前文獻(xiàn)所顯示的心肌損傷高特異性指標(biāo)如CTnT［9］以及直接反應(yīng)心肌損傷程度的心肌細(xì)胞凋亡率均在造模后較空白對照組明顯升高（P＜0.05），與張東等［10］近期就膿毒癥肌鈣蛋白變化結(jié)果相接近，以上均提示采用CLP造模后大鼠存在明顯的心肌損傷，符合本研究的要求，故該膿毒癥模型可用于膿毒癥心肌保護(hù)的研究。

膿毒癥早期屬于中醫(yī)學(xué)“毒熱癥”、“肺熱病”等范疇，病理機(jī)制以實(shí)證、熱證為主；當(dāng)而疾病繼續(xù)發(fā)展其病機(jī)逐漸由“閉”向“脫”方向發(fā)展，后期一般都表現(xiàn)出陽氣虛衰、心陽不振的證候特點(diǎn)，故晚期膿毒癥多歸于“脫證”范疇。四逆湯是治療一切陽氣虛衰證的代表方，符合膿毒癥中、晚期的辨證施治原則。目前國內(nèi)文獻(xiàn)提示四逆湯在抗缺血再灌注損傷引起心肌損傷方面有較顯著的療效［3-4］，且還對二次打擊所造成的MODS大鼠具有免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化作用［11］，故使用四逆湯對中晚期膿毒癥進(jìn)行干預(yù)符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理生理學(xué)觀點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過四逆湯干預(yù)后，高、低劑量治療組cTnT水平以及心肌細(xì)胞凋亡率均較模型組明顯下降，說明四逆湯能減輕中晚期膿毒癥心肌損傷。

對于SIMD，目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為其可能機(jī)制主要為各種因素導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能性抑制和心肌細(xì)胞實(shí)質(zhì)性損害［7，12］。而且腫瘤壞死因子、一氧化氮等炎癥介質(zhì)的啟動內(nèi)、外源性心肌細(xì)胞凋亡通路加快細(xì)胞凋亡的學(xué)說逐漸被基礎(chǔ)研究所驗(yàn)證［2］。故在現(xiàn)有研究指導(dǎo)下學(xué)者們逐漸把抑制炎癥介質(zhì)、延緩心肌細(xì)胞凋亡作為保護(hù)膿毒癥心肌功能障礙的重點(diǎn)研究方向?，F(xiàn)有研究指出TNF-α是膿毒癥發(fā)展過程中的中心介質(zhì)之一，可通過多種機(jī)制造成心肌損傷［13］。而IL-10是人類最強(qiáng)的抗炎介質(zhì)，研究顯示嚴(yán)重膿毒癥IL-10水平與其病情相平行［14］，說明膿毒癥晚期存在嚴(yán)重免疫功能紊亂狀態(tài)，促炎、抗炎介質(zhì)大量釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組血清TNF-α和IL-10均較正常組明顯升高，進(jìn)一步驗(yàn)證前面文獻(xiàn)所指出的免疫紊亂狀態(tài)的觀點(diǎn)。經(jīng)四逆湯干預(yù)后TNF-α、IL-10均出現(xiàn)顯著性下降。說明四逆湯在平衡中晚期膿毒癥大鼠炎癥、抗炎反應(yīng)，糾正免疫功能紊亂方面起到一定的作用。

綜上所述，本研究在CLP膿毒癥大鼠模型上觀察到中晚期膿毒癥大鼠存在嚴(yán)重的免疫功能紊亂以及明顯的心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡加速。經(jīng)過四逆湯干預(yù)后大鼠促炎、抗炎反應(yīng)均出現(xiàn)不同程度的減退，而且心肌損傷程度下降、心肌細(xì)胞凋亡延緩。故四逆湯具有減輕心肌細(xì)胞損傷，延緩心肌細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制有可能與其糾正中晚期膿毒癥大鼠免疫功能紊亂有關(guān)。

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Protection Effects of Sini Decoction on Cardiac Myocytes in Middle-late Stage of Sepsis Rats

HAN Yun，XIE Dongping，LAI Fang，et al.Fangcun Branch Hospital，Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine，Guangdong，Guangzhou 510145，China

Objective：To observe effects of Sini Decoction on cardiac myocytes in middle-late stage of sepsis rats.Methods：70 male SPF rats were randomly distributed into control group（10 rats），sepsis model group（20 rats），low-dose Sini Decoction treatment group（20 rats）and high-dose Sini Decoction treatment group（20 rats）. Sepsis model of rats was induced by the method of cecal ligation and puncture（CLP），and treatments were administered 72 h post-CLP.Survival rates on the 7th day post-CLP were observed.Blood samples were collected from abdominal aortas for testing the level of TNF-α，IL-10 and cTnT.Cardiac myocytes apoptotic cells were detected by TUNEL.Results：The differences in the 7 th day survival rates between sepsis model group，low-dose Sini Decoction treatment group and high-dose Sini Decoction treatment group were not significant.Significant declines were detected in TNF-α，IL-10 and cTnT level after Sini Decoction treatment（both low and high dose）.There were significant declines in both high and low dose Sini Decoction treatment groups comparing with the sepsis model group on the apoptotic rates of cardiac myocytes，but there was no significant difference when comparing between the high and low dose Sini Decoction treatment groups.Conclusion：Sini Decoction might reduce myocardial injury and delay apoptosis of cardiac myocytes in middle-late stage of sepsis rats through improving immune function and suppressing the release of inflammatory mediators.

Sepsis；Cardiac myocytes dysfunction；Cardiac myocytes apoptosis；Sini Decoction

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0027-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.009

2014-10-13）

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（9151040701000046）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031700033）