遲映雪　宮麗鴻

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽110000，2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽110000）

·研究報(bào)告·

搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊HO-1和PPARγ表達(dá)的影響*

遲映雪1宮麗鴻2

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽110000，2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽110000）

目的觀察搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方對(duì)AopE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化（AS）不穩(wěn)定斑塊血紅素氧化酶（HO-1）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的影響。方法將造模成功的ApoE基因敲除小鼠，分別給予阿托伐他汀以及低劑量、中劑量、高劑量穩(wěn)斑湯干預(yù)，模型對(duì)照組采用生理鹽水灌胃。給藥13周后，取腹主動(dòng)脈脈，取小鼠主動(dòng)脈組織HE染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，并采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HO-1和PPARγ的表達(dá)水平。結(jié)果各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中HO-1和PPARγ的表達(dá)水平治療組明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯可能通過影響HO-1和PPARγ的表達(dá)而干預(yù)AS斑塊形成及破裂。

搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方ApoE基因敲除小鼠AS不穩(wěn)定斑塊HO-1PPARγ

急性冠脈綜合征為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定性斑塊致易損性斑塊、不穩(wěn)定斑塊破裂、血栓形成而產(chǎn)生的，動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂是引起急性心臟事件的原因。因此穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊為防治急性冠脈綜合征的關(guān)鍵一環(huán)。目前常規(guī)西藥在防治冠心病過程中對(duì)肝功能、腎功能的損害無法避免，而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂的中藥防治的研究是人們關(guān)注的新熱點(diǎn)和方向。本實(shí)驗(yàn)以ApoE基因敲除小鼠為研究對(duì)象，通過高脂飼養(yǎng)造出動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊模型，并給搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯干預(yù)，研究斑塊中的血紅素氧化酶（HO-1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達(dá)情況，以推測(cè)其在斑塊形成及破裂中的作用，從而為中藥有效安全的穩(wěn)定斑塊提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡Apo E基因敲除小鼠（系C57BL/6 J，北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)并培育成功）70只，雌雄各半，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g。

1.2藥物穩(wěn)斑湯，藥物組成：全蝎10 g，蜈蚣2條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術(shù)15 g，水蛭15 g。藥材由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液備用。

1.3試劑和儀器SP試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。兩步法RT-PCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.4模型制備小鼠飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料（60Coγ滅菌照射處理），13周后，隨機(jī)處死4只，取腹主動(dòng)脈根部，HE染色觀察基礎(chǔ)動(dòng)脈粥樣硬化硬度，確定造模成功。

1.5分組及給藥將造模成功的ApoE基因敲除小鼠60只隨機(jī)分為模型對(duì)照組、穩(wěn)斑湯低劑量組、穩(wěn)斑湯中劑量組、穩(wěn)斑湯高劑量組及西藥組，每組12只。正常C57BL/6 J小鼠12只設(shè)為空白對(duì)照組，給予正常飼料喂養(yǎng)。空白對(duì)照組小鼠不給藥，模型對(duì)照組給予0.3 mL/d的生理鹽水；根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.0折算成小鼠用量。穩(wěn)斑湯低劑量組給予穩(wěn)斑湯61.75 g/（kg·d）、穩(wěn)斑湯中劑量組給予穩(wěn)斑湯123.5 g/（kg·d）、穩(wěn)斑湯高劑量組給予穩(wěn)斑湯247 g/（kg·d），西藥組給予阿托伐他汀鈣0.27 mg/（kg·d），各組均灌胃給藥13周，每日1次。

1.6標(biāo)本采集與檢測(cè)取材前夜禁食，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存?zhèn)?。處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動(dòng)脈，心臟10%甲醛固定，主動(dòng)脈放在凍存管內(nèi)液氮驟冷保存。

1.6.1主動(dòng)脈組織病理學(xué)觀察每組隨機(jī)取5只小鼠，麻醉處死，無菌條件下取每只小鼠的主動(dòng)脈根部取4個(gè)相同的切面，分別為（1）升主動(dòng)脈最近端橫截面，切面形態(tài)呈圓形；（2）主動(dòng)脈瓣附著部位，并有冠狀動(dòng)脈開口；（3）主動(dòng)脈瓣起始橫截面；（4）主動(dòng)脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起，生理鹽水沖洗，10%甲醛中性溶液固定。常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片，厚度約5 μm。HE染色，普通光鏡下觀察主動(dòng)脈根部組織及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)；Masson染色，普通光鏡下觀察各斑塊中纖維成分的分布。

1.6.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用SP法，常規(guī)滴加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，用有計(jì)數(shù)格的目鏡，高倍視野下計(jì)數(shù)浸潤于內(nèi)膜的單核細(xì)胞數(shù)，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取其平均值，即為該標(biāo)本單核細(xì)胞浸潤數(shù)值。以染色系數(shù)統(tǒng)計(jì)HO-1免疫組化染色結(jié)果。

1.6.3實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)先提取總RNA，然后取4 μL總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物等反應(yīng)物混合配成20 μL體系，42℃15 min，95℃，2 min反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，分別對(duì)小鼠PPARγ、HO-1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。組間比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用方差分析，不同指標(biāo)間用直線相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠形態(tài)學(xué)改變的比較各組小鼠腹主動(dòng)脈HE染色形態(tài)學(xué)改變見圖1?？瞻讓?duì)照組：動(dòng)脈內(nèi)膜附有一層內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞層呈現(xiàn)皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞。模型對(duì)照組：血管腔內(nèi)可見明顯的粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細(xì)胞、彈力纖維和膠原組織構(gòu)成，斑塊中央可見大量的脂質(zhì)聚集，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞，偶見炎性細(xì)胞浸潤；未出現(xiàn)斑塊的動(dòng)脈內(nèi)膜區(qū)域嚴(yán)重破損。穩(wěn)斑湯低劑量組：血管腔內(nèi)可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對(duì)照組，斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量較模型組少，斑塊內(nèi)可見少量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞；未出現(xiàn)斑塊的動(dòng)脈內(nèi)膜區(qū)域形態(tài)較為完整，偶見內(nèi)膜殘缺。穩(wěn)斑湯中劑量組、穩(wěn)斑湯高劑量、西藥組：動(dòng)脈內(nèi)膜大部分較為光滑，偶見內(nèi)膜不全，內(nèi)膜不全區(qū)域可見明顯的脂質(zhì)條紋塊形成，偶見泡沫細(xì)胞聚集，有少量纖維成分交聯(lián)。

圖1　各組小鼠腹主動(dòng)脈（HE染色，100倍）

2.2各組小鼠HO-1表達(dá)水平比較見圖2。HO-1蛋白陽性表達(dá)主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、泡沫細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）內(nèi)，以含棕褐色顆粒的細(xì)胞為HO-1蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組陽性細(xì)胞主要分布于內(nèi)膜，HO-1蛋白表達(dá)在EC內(nèi)；模型組HO-1蛋白表達(dá)明顯降低，偶見弱陽性表達(dá)；中藥中劑量、高劑量及西藥組表達(dá)水平顯著升高，廣泛表達(dá)于EC、VSMC及斑塊的泡沫細(xì)胞內(nèi)。

圖2　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織（DAB顯色，100倍）

各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中HO-1表達(dá)水平見表1、表2和圖3。Apo E基因敲除小鼠的免疫組化結(jié)果表明，穩(wěn)斑湯和阿托伐他汀均能提高斑塊內(nèi)HO-1的陽性表達(dá)（P＜0.01）。

表1　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中HO-1蛋白表達(dá)水平（±s）

表1　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中HO-1蛋白表達(dá)水平（±s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n空白對(duì)照組5模型對(duì)照組5穩(wěn)斑湯低劑量組5 HO-1蛋白表達(dá)0.265±0.009 0.199±0.011*0.283±0.009*△穩(wěn)斑湯中劑量組50.310±0.010*△穩(wěn)斑湯高劑量組50.317±0.012*△西藥組50.315±0.008*△

2.3各組小鼠PPAR-γ表達(dá)水平比較見表3，圖4。Apo E-小鼠的RT-PCR結(jié)果表明，搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯和阿托伐他汀均能提高各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中PPAR-γ mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。

表2　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中HO-1 mRNA表達(dá)水平（±s）

表2　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中HO-1 mRNA表達(dá)水平（±s）

組別n空白對(duì)照組5模型對(duì)照組5穩(wěn)斑湯低劑量組5 HO-1 mRNA表達(dá)水平0.270±0.024 0.227±0.022*0.290±0.037△△穩(wěn)斑湯中劑量組50.318±0.029*△△穩(wěn)斑湯高劑量組50.367±0.041**△△西藥組50.385±0.033**△△

圖3　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中HO-1 mRNA表達(dá)電泳圖

表3　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中PPARγ mRNA表達(dá)水平（±s）

表3　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中PPARγ mRNA表達(dá)水平（±s）

組別n空白對(duì)照組5模型對(duì)照組5穩(wěn)斑湯低劑量組5 PPARγ mRNA表達(dá)水平0.266±0.013 0.228±0.013*0.290±0.028△穩(wěn)斑湯中劑量組50.347±0.026*△穩(wěn)斑湯高劑量組50.395±0.013*△西藥組50.405±0.021*△

圖4　各組小鼠腹主動(dòng)脈組織中PPARγ mRNA表達(dá)電泳圖

3　討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是一個(gè)由多種因素參與的漫長復(fù)雜的過程，其發(fā)病機(jī)制尚不明晰，炎性反應(yīng)在不穩(wěn)定斑塊形成及破裂中起著重要作用。HO是血紅素代謝的起始酶和限速酶，有HO-1、HO-2、HO-3 3種存在形式，近年研究表明［1］，HO-1對(duì)心血管系統(tǒng)具有重要的保護(hù)作用。心臟過表達(dá)HO-1的小鼠具有改善缺血/再灌注損傷心功能和抗細(xì)胞凋亡作用［2］。研究認(rèn)為在動(dòng)脈硬化斑塊中PPARγ可以抑制單核巨噬細(xì)胞表達(dá)炎性物質(zhì)減輕炎性反應(yīng)并具有抑制血管平滑肌細(xì)胞游走和增生的作用［3］。Jagdip等［4］研究發(fā)現(xiàn)PPAR激動(dòng)劑羅格列酮能明顯降低無糖尿病的冠心病患者E-選擇素血管性假血友病因子、C反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原和IRI，減輕炎癥。反應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)ACS組PPARγ mRNA表達(dá)比SAP組明顯降低PPARγ mRNA表達(dá)與冠脈病變支數(shù)病變類型呈負(fù)相關(guān)進(jìn)一步說明PPARγ mRNA表達(dá)與冠脈病變呈負(fù)相關(guān)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有負(fù)調(diào)控作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痰濁由津液凝聚而成，津血同源，都因水谷精微化生。長期恣食肥甘厚味易生痰濁而成為痰濁形成的外因。痰濁一旦形成上犯于胸，致胸陽痹阻，又可壅滯脈道，使氣血不能暢行，致心脈痹阻而成胸痹?！毒霸廊珪贰疤碉嫛闭J(rèn)為“果使脾強(qiáng)胃健，如少壯者流，則水谷隨食隨化，皆成氣血，焉得留而為痰”。張仲景論胸痹之脈為陽微陰弦，浮取而微，系胸中陽氣虛衰，沉取而弦乃陰寒之邪內(nèi)盛，痰涎水飲壅阻，邪正博結(jié)，形成胸中阻塞而痛。本實(shí)驗(yàn)選用復(fù)方穩(wěn)斑湯，方中全蝎、蜈蚣息風(fēng)止痙、解毒散結(jié)，蜈蚣兼能通絡(luò)止痛；地龍清熱息風(fēng)、平喘通絡(luò)止痙，共為君藥。陳皮、半夏、白術(shù)合用，既能燥濕化痰又可寬胸理氣、消痞散結(jié)，為臣藥。水蛭為蟲類活血藥、破血逐瘀，為佐藥。合方共奏搜風(fēng)祛瘀通絡(luò)之功效。風(fēng)為百病之長，其性善行而數(shù)變；痰為百病之祟。風(fēng)藥善于宣暢氣機(jī)，疏通血絡(luò)，消除瘀滯，尤其蟲類風(fēng)藥更以行走攻竄見長，善通經(jīng)絡(luò)壅滯，開啟孔竅閉塞，故能通利心絡(luò)，開通心竅，善止痹痛。近年來，隨著“痰邪致病”理論的深入認(rèn)識(shí)，痰瘀互結(jié)被認(rèn)為是冠心病的重要病機(jī)［5-6］。沈紹功［7］認(rèn)為，冠心病的治療應(yīng)從傳統(tǒng)的“活血化瘀”、“補(bǔ)氣活血”轉(zhuǎn)到“補(bǔ)氣祛痰”、“痰瘀同治”上來，提出痰濁虛證宜補(bǔ)氣祛痰，痰濁實(shí)證宜痰瘀同治。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯能有效干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及破裂．其可能通過調(diào)節(jié)HO-1和PPARγ的表達(dá)發(fā)揮作用。

［1］William Durante．Heine oxygenase-1 in growth control and its clinical application to vascular disease［J］．Journal of Cellular Physiology，2003，195（6）：373-382．

［2］Yet SF，Tian R，Layne MD，et al.Cardiac-specific expression of hemeoxygenase-1 protects against ischemia and reperfusion injury intransgenic mice［J］.Circ Res，2001，2（89）：168-173.

［3］RE Law，S Goetze，Xiaoping Xi，et al.Expression and function of PPARγ in rat and human vascular smooth muscle cells［J］. Circulation，2000，101：1311.

［4］Jagdip SS，Dahlia C，Juan CK.The effects of rosiglitazone a peroxisome proliferator activated receptor-gamma agonist on markers of endothelial cell activation C-reactive protein and fibrinogen levels in non-diabetic coronary artery disease patients［J］.J Am Coll Cardio，2003，11（42）：1757.

［5］韓學(xué)杰．冠心病心絞痛痰瘀互結(jié)證的本質(zhì)探討［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002，8（10）：53．

［6］徐學(xué)勤，陳慶云．試論痰瘀與冠心病的相關(guān)問題［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002，8（10）：55．

［7］沈紹功，診治冠心病的新思路［J］.中國中醫(yī)急癥，1999，8（2）：51.

Study of Compound Soufengqutanwenban Decoction on Expression of HO-1 and PPARγ in ApoE Gene Knock-out Rats with Atherosclerosis Unstable Plaque

CHI Yingxue1，GONG Lihong2.1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110000，China；2 Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110000，China

Objective：To observe the effect of Compound Soufengqutanwenban Decoction on unstable plaque in ApoE gene knockout rats with atherosclerosis.Methods：The successful model of the ApoE-gene knockout rats were given low dose，medium-dose and high-dose Soufengqutanwenban Decoction and western medicine for a month.At the same time，the model group was fed by normal saline for one month.After treatment for 13 weeks，aortic tissue was observed under optical microscope pathology after HE staining.And then levels of HO-1 and PPARγ were detected by immunohistochemistry and RT-PCR technique.Results：HO-1 and PPARγ expression levels in aortic tissue of rats in treatment groups were significantly higher than those in control group（P＜0.01）.Conclusion：Compound Soufengqutanwenban Decoction may stabilize plaques by regulating the expression of inflammatory factors and interfering the formation and rupture of AS plaque，which provides a new idea to prevent AS.

Compound Soufengqutanwenban Decoction；ApoE gene knockout rats；AS；Unstable plaque；HO-1；PPARγ

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0004-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.002

2014-10-19）

中國博士后面上項(xiàng)目（20110491540）；遼寧省百千萬人才項(xiàng)目（2011921022）