蔡 彥 李楚天 林黃果 邱思婕

（廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

子午流注針刺法對(duì)哮喘模型豚鼠氣道重塑的干預(yù)作用*

蔡 彥 李楚天 林黃果 邱思婕

（廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

目的 探討納子法對(duì)哮喘豚鼠模型氣道重塑的針灸治療效果，揭示子午流注納子法針對(duì)哮喘氣道重塑的機(jī)理，為臨床運(yùn)用子午流注治療哮喘提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將32只健康豚鼠分為A組于申時(shí)（15:00-17:00）進(jìn)行電針，B組于巳時(shí)（9:00-11:00）進(jìn)行電針，C組造模不治療和D組（正常對(duì)照組），每組8只，并采用雞卵白蛋白致敏法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性哮喘模型，以此觀察4組豚鼠的氣道壁和氣道平滑肌厚度及肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1含量的變化情況。結(jié)果 A、B組與C組比較，肺內(nèi)氣管壁厚度、平滑肌厚度以及TGF-β1含量均明顯降低（P＜0.01）；且A組比B組更能有效降低厚度及TGF-β1含量。結(jié)論 電針治療能阻止哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，并且按時(shí)辰取穴的納子針?lè)ㄉ陼r(shí)治療A組的哮喘氣道重塑改善情況優(yōu)于不按時(shí)辰治療的巳時(shí)B組，提示按時(shí)辰針灸對(duì)哮喘療效更佳。

納子法 哮喘 氣道重塑

支氣管哮喘是常見、多發(fā)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，目前其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢(shì)。一般認(rèn)為哮喘基本特征為氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑，氣道重塑是難治性哮喘的重要發(fā)病機(jī)制，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1是其中一個(gè)重要影響因素［1］。中醫(yī)子午流注針?lè)ㄖ委熛幸欢ǒ熜?，但涉及納子法實(shí)驗(yàn)偏少。本研究探討子午流注針?lè)▽?duì)哮喘模型氣道壁和氣道平滑肌厚度及肺組織TGF-β1的變化情況，揭示子午流注納子法的治療機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供可靠的理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 普通級(jí)豚鼠屬白化豚鼠32只 ［花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物許可證：SCXK（粵）2009-0023］，體質(zhì)量300～400 g，雌雄各半。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C、D 4組，每組8只。電針申時(shí)（15∶00-17∶00）組（A組）、電針?biāo)葧r(shí)（9∶00-11∶00）組（B組）、模型不治療組（C組）和正常對(duì)照組（D組），每組8只。

1.2 藥物及設(shè)備 雞卵白蛋白（美國(guó)sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：A5253供）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1成套免疫組化試劑盒 （購(gòu)自武漢博士德生物工程公司）；粵華WH2-2000型超聲霧化儀 （廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）；EG1150H型石蠟包埋機(jī)（德國(guó)徠卡儀器公司）；ASP200S型生物組織脫水機(jī) （德國(guó)徠卡儀器公司）；RM2245型石蠟切片機(jī) （德國(guó)徠卡儀器公司）；5020型石蠟染色機(jī) （德國(guó)徠卡儀器公司）；DK-600S水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；圖像采集系統(tǒng)、采集軟件（日本OLYMPUS公司）。

1.3 模型制備［2］在相同環(huán)境下先將動(dòng)物飼養(yǎng)3d以適應(yīng)環(huán)境后開始造模。第4日，除D組外，其余組均采用雞卵白蛋白致敏，常規(guī)消毒后一次性腹腔注射10%雞卵白蛋白生理鹽水1mL，使豚鼠處于致敏狀態(tài)。致敏后第7日將A、B、C組動(dòng)物置特制激發(fā)箱內(nèi)，以1%雞卵清蛋白溶液噴霧激發(fā)，按個(gè)體差異每次激發(fā)2～10min，直至“哮喘”發(fā)作，表現(xiàn)為腹式呼吸明顯，呼吸頻率加快且節(jié)律不整、活動(dòng)減少等癥狀。豚鼠連噴4d。D組以等量生理鹽水1mL腹腔注入，7d后同時(shí)將動(dòng)物放入激發(fā)箱內(nèi)，并以生理鹽水10mL噴霧，每次10min，連續(xù)4d。

1.4 治療方法［3］造模成功后，A組在每日16∶00［屬肺經(jīng)晝夜氣血盛峰值申時(shí)（15：00-17：00）］電針治療。B組在每日11∶00［屬肺經(jīng)晝夜氣血盛衰非峰非谷值巳時(shí)（9：00-11：00）］電針治療。穴位選取定喘、肺俞、尺澤穴（取穴方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［4］）。每次治療10min，每日治療1次，7d為1療程，共治療2療程。C、D組不給予任何干預(yù)治療。

1.5 標(biāo)本制備 取材末次治療后第2日，各組動(dòng)物麻醉后取出右肺，標(biāo)本用10%多聚甲醛固定，從固定部位切取右肺組織塊。常規(guī)石蠟包埋和切片，片厚3μm，分別行HE染色、Masson染色和免疫組化染色。

1.6 檢測(cè)方法 采用圖像分析系統(tǒng)，每張切片在200倍顯微鏡下，確定完整支氣管橫截面，分別測(cè)取其支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管總面積（Wat1）、管腔面積（Wat2）和平滑肌面積（WAm），并用Pbm將測(cè)量值標(biāo)化，分別以（Wat1-Wat2）/Pbm和WAm/Pbm表示支氣管壁厚度和平滑肌厚度，每個(gè)支氣管各測(cè)5次，取其均值。采用免疫組化測(cè)定肺組織中TGF-β1的含量［5］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析的SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺組織大體改變 C組豚鼠肺組織較D組腫脹明顯，表面可見瘀紫色暗區(qū)，顏色略顯蒼白，切面可見渾濁分泌物滲出。A、B組有上述改變，但程度輕微。2.2 各組肺組織病理學(xué)改變 見圖1。C組豚鼠肺組織支氣管黏膜腫脹水腫、充血，氣道內(nèi)肥大細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁和基底膜增厚，支氣管管腔變窄，其內(nèi)可見炎癥細(xì)胞和分泌物滲出。A、B組豚鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變較C組減輕，且A組要優(yōu)于B組。D組豚鼠肺組織完整正常，未發(fā)現(xiàn)上述情況。

圖1 各組氣道病理切片（HE染色，200倍）

2.3 各組間支氣管壁厚度、平滑肌厚度及TGF-β1含量比較 見表1。A、B、C組豚鼠氣管壁厚度、平滑肌厚度和TGF-β1均較D組升高，A、B兩組與C組比較均有降低，且A組較B組降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組支氣管壁厚度、平滑肌厚度及TGF-β1含量比較（±s）

表1 各組支氣管壁厚度、平滑肌厚度及TGF-β1含量比較（±s）

與D組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05；與B組比較，▲P＜0.05。

組 別 平滑肌厚度（μm2/μm）氣管壁厚度（μm2/μm）TGF-β1A組 4.09±0.11△▲* 5.61±0.26△▲*16.46±0.64△▲*B組 5.02±0.21△* 6.21±0.28△*19.26±0.48△*C組 7.17±0.23* 15.45±0.37*31.68±1.05*D組 3.21±0.13 4.33±0.2910.19±0.10

3 討 論

氣道重塑是指氣道組織結(jié)構(gòu)的病理生理改變，以纖維增生，肌成纖維細(xì)胞增生、膠原沉積、氣道平滑肌細(xì)胞增生肥大，網(wǎng)狀基底膜的增厚為典型特征，被認(rèn)為是導(dǎo)致氣道不可逆阻塞和氣道高反應(yīng)性的重要原因之一，它在支氣管哮喘發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可引起哮喘患者癥狀加重和肺功能降低［6］。而在研究氣道重塑中氣道結(jié)構(gòu)改變中，有研究表明［7］，可溶性生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)和酶等多種因素參與氣道重建，其中在眾多因子中TGF-β1在氣道重建中的作用，已被眾多學(xué)者認(rèn)可。且TGF-β1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積最強(qiáng)的促進(jìn)劑，不僅能刺激成纖維細(xì)胞增殖及分泌膠原，還能抑制膠原的降解?？梢姎獾乐厮苁且粋€(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其通過(guò)調(diào)控肺組織的TGF-β1進(jìn)行表達(dá)反應(yīng)，與氣道炎癥一樣在哮喘的發(fā)病機(jī)制中扮演著非常重要的角色。

子午流注納子法是按照一天中的時(shí)辰順序，配合十二經(jīng)的氣血流注，利用五輸穴的五行關(guān)系，通過(guò)子母補(bǔ)瀉的方法選穴治療，其優(yōu)越性就在于強(qiáng)調(diào)選擇針治時(shí)間的同時(shí)亦強(qiáng)調(diào)選取適當(dāng)穴位，從而最大限度地發(fā)揮穴位的效應(yīng)［8］。近年來(lái)，遵循中醫(yī)學(xué)“內(nèi)病外治，殊途同歸”等治療原則，越來(lái)越多的中醫(yī)外治法應(yīng)用于哮喘的治療，尤其是納子針?lè)ㄔ谂R床上取得不錯(cuò)的療效。很早就有學(xué)者提出［9］，支氣管哮喘多在后半夜顯得厲害，按照子午流注中的“納子法”，寅時(shí)（3∶00-5∶00）乃是氣血入肺之時(shí)，此時(shí)針刺肺經(jīng)之穴療效優(yōu)于他時(shí)。而筆者［10］同樣發(fā)現(xiàn)按時(shí)辰取穴的納子法電針治療哮喘的療效優(yōu)于不按時(shí)辰治療者，并認(rèn)為其機(jī)制可能與降低模型豚鼠氣道的EOS計(jì)數(shù)與凋亡率有關(guān)。但由于豚鼠為嚙齒類動(dòng)物，其晝夜活動(dòng)周期與人類完全相反［11］，故豚鼠肺經(jīng)晝夜氣血盛峰值時(shí)辰應(yīng)為寅時(shí)的對(duì)時(shí)申時(shí)（15∶00-17∶00）。故根據(jù)納子法理論，本實(shí)驗(yàn)選擇肺經(jīng)晝夜氣血盛峰值時(shí)辰申時(shí)（15∶00-17∶00），與非峰非谷值時(shí)辰巳時(shí)（9∶00-11∶00），對(duì)哮喘豚鼠模型分別采用電針定喘、肺俞、尺澤3穴治療，以觀察擇時(shí)治療的效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，哮喘豚鼠模型經(jīng)電針定喘、肺俞、尺澤穴治療后，豚鼠氣管壁厚度及平滑肌厚度增厚均明顯減輕，TGF-β1值降低，與模型不治療組相比有顯著差異，說(shuō)明針灸有抑制平滑肌增殖的作用，減緩了氣道重塑的發(fā)生。且申時(shí)即肺經(jīng)氣血旺盛時(shí)施治有良好療效，證實(shí)了擇時(shí)與不擇時(shí)治療之間產(chǎn)生顯著性差異，揭示時(shí)辰與一定的穴位配伍可產(chǎn)生協(xié)同作用，其可能通過(guò)制止豚鼠氣道重塑來(lái)達(dá)到治療目的，提示臨床治療時(shí)應(yīng)盡量采用該疾病所處經(jīng)脈氣血旺的時(shí)辰施治。

［1］Royce SG，Cheng V，Samuel CS，et al.The regulation of fibrosis inairway remodeling in asthma［J］.Mol Cell Endocrinol，2012，351（2）：167-l75.

［2］呂國(guó)平，崔德建.介紹一種建立大鼠哮喘模型的實(shí)驗(yàn)方法［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志1995，18（6）：377.

［3］鄒移海.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：90-93，152-161，176-203.

［4］李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：105.

［5］張玉英，惠朋利.姜辛夏顆粒對(duì)哮喘大鼠氣道重建TGF-β1表達(dá)的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，13（8）：1941-1943.

［6］Halwani R，A1-Muhsen S，Harold Q.Airway remodeling inasthma［J］.Curr Opin Pharmacol，2010，10（3）：236-245.

［7］殷曉峰，馮玉麟.大鼠哮喘模型中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)氣道重構(gòu)調(diào)節(jié)作用的研究［J］.中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2002，1（3）：157.

［8］涂乾.子午流注納支法對(duì)大鼠乙酸性胃潰瘍愈合質(zhì)量影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.武漢市職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，29（3）：21.

［9］馬向東，徐球菊.子午流注與支氣管哮喘［J］.包頭醫(yī)學(xué)，2001，25（3）：124.

［10］蔡彥，陳文裕，陳創(chuàng)榮，等.納子法電針治療對(duì)哮喘模型豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（2）：124-127.

［11］伊藤真次.人體晝夜節(jié)律［M］.重慶：重慶出版社，1983：150-155.

E fects of M idnight-noon and Ebb-flow Acupuncture Therapy on Airway Remodeling in Asthmatic Guinea Pigs

CAI Yan，LI Chutian，LIN Huangguo，et al. Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangdong，Guangzhou 510120，China

Objective：To observe the Midnight-noon and Ebb-flow Acupuncture therapeutic effect on airway remodeling of asthma guinea pig model and to reveal the mechanism of it which provided experimental basis for clinical application of the Midnight-noon Ebb-flow Acupuncture in treatment of asthma.Methods：32 healthy guinea pigs were divided into A group with electroacupuncture in Shen shi group（from 15：00 to 17：00 PM），the B group with electroacupuncture in Si shi Group（from 9：00-11：00），the C group with no treatment and he D group with normal control therapies.And chicken ovalbumin sensitization method was used to copy the model of experimental asthma to observe the 4 groups of guinea pig airway thickness and airway smooth muscle and the change of TGF-β1content in lung tissue.Results：Compared with the C group，intrapulmonary airway wall thickness，smooth muscle thickness and the content of TGF-β1were decreased significantly in the A group and B group（P＜0.01）.And the reductions of thickness and TGF-β1in the A group were more effectively than those in the B group.Conclusion：Electroacupuncture treatment can prevent the occurrence and development of airway remodeling in asthma.It is better efficacy on treating asthma on time that the time points of the Shen shi group of airway remodeling in asthma were better than those of no in accordance with the hour treatment in Si shi group.

Midnight-noon and ebb-flow doctrine；Asthma；Airway remodeling

R246

A

1004-745X（2015）05-0778-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.009

2015-02-24）

廣東省中醫(yī)藥管理局課題（20131199）